白茹 何婷 謝能

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),是一類和年齡相關的中樞神經系統(tǒng)變性病變,在病程上存在進行性慢性特點,主要表現(xiàn)為進行性認知機能受損、人格精神障礙?；?020年美國AD協(xié)會公布的事實與數(shù)據(jù)報告可知,2000至2018年因心臟病死亡的例數(shù)下降7.8%,因AD死亡的例數(shù)則上調了146%,全世界現(xiàn)有約7 000萬至1億早期阿AD患者,預計到2050年,將增至1.52億以上。我國現(xiàn)有AD患者的數(shù)量超過1 000萬[1]。據(jù)2020年發(fā)布的《中國阿爾茨海默病患者家庭生存狀況調研報告》預測,隨著我國老齡化的不斷深入,預計到2050年中國AD患病人數(shù)將超過4 000萬。到2020年為止,全國年齡≥65歲者的數(shù)量為1.91億左右,為13.50%占比,而今后,此年齡群的人口數(shù)量的增幅會最高,同時為AD的高發(fā)群體[2]。但我國當前防治AD,存在諸多難題,包括公眾認知度低、未研究出有效的藥物療法、患病率高且就診率低、照護難度高、疾病壓力大等。增強全社會的AD預防意識,探尋AD的早篩方法,推動預防關口前移,已經成為我國應對老齡化,應對AD的關鍵。

1 AD的病理機制

AD的病理機制目前尚不明晰,目前概括為神經退行性變化和炎性反應兩部分。神經退行性變化涉及神經元變性、神經細胞凋亡、新生神經元的產生。炎性反應是指AD患者腦中的炎性反應,包括活化的細胞因子和炎性細胞因子的釋放。此外,許多研究表明,AD的病理機制還受到蛋白質氧化應激的影響[1,2]。氧化應激是指細胞內缺氧或缺氧的情況下,自由基的產生和活性氧的增加,從而導致細胞結構和功能的破壞。研究發(fā)現(xiàn),氧化應激可以影響AD患者腦中神經細胞的凋亡和變性,從而增加病變的嚴重程度[1]。有報道稱AD還受到神經遞質的影響,AD病患者大腦中的神經遞質水平低于正常人,這可能是導致AD患者出現(xiàn)認知障礙的原因之一[2]。此外,AD患者大腦內有明顯的淀粉樣變性現(xiàn)象。淀粉樣變性是指在AD患者大腦中出現(xiàn)的多種病理變化,其中包括淀粉樣結晶、神經元的變性、神經細胞的凋亡等。而此類病變可能是AD的一項關鍵病因,同時為AD的診斷標志物。

2 AD生物標志物

因AD的病程的不可逆性,筆者發(fā)現(xiàn)截止當前尚未研究出有效的治療方法與藥物,所以,在治療AD方面,早期診斷為其核心工作。近年來,研究人員對AD診斷標志物的研究取得了長足的進展,從而推動了該病的早期診斷和有效的治療。在過去的幾十年里,研究人員一直在研究AD診斷標志物,如神經影像學技術、生物化學技術、分子生物學技術等。神經影像學技術是目前最常用的AD診斷標志物,包括磁共振成像(MRI)、腦血流成像(CBF)、腦電圖(EEG)等。它們都可以提供準確的診斷信息,從而幫助醫(yī)生確定患者的病情。隨著AD早篩診斷的迫切需要,人們將目光聚焦于采用生物標志物來特異性的診斷AD[1]。這些特異的生物標志物與 AD的病理表現(xiàn)和疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切的關系,對AD的早期診斷以及預測從輕度認知障礙向AD進展及治療效果等方面具有重要的意義。有研究者采用生物化學技術,如血清學和尿液分析,開展對AD的早期診斷[3]。血清學檢查可以檢測血清中的淀粉樣蛋白(Aβ)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、谷氨酸氨基轉移酶(ALT)等。尿液分析也可以檢測尿液中的Aβ。此外,分子生物學技術也被應用于AD的早期診斷。其中,聚合酶鏈反應(PCR)可以檢測AD的遺傳標志物,從而有助于早期診斷。目前也有研究人員利用基因組學技術,檢測AD的基因突變,從而提供準確的診斷信息。

2.1 遺傳學標志物 基于發(fā)病年齡,可將AD劃分成早發(fā)性(發(fā)病時年齡<65歲)、晚發(fā)性(發(fā)病時年齡≥65歲);以存在家族史與否為依據(jù),AD又存在家族性、散發(fā)性之分。在占比方面,早發(fā)性AD為5%左右,在早發(fā)性AD中,61.5%者為家族性AD。對于早發(fā)性AD而言,APP、PSEN1與PSEN2基因是其廣泛認可的相關基因,80%左右的早發(fā)性家族性AD存在這3類基因的突變現(xiàn)象[2]。

載脂蛋白Eε4(APOEε4)是晚發(fā)性 AD十分明確的風險基因,可能會促使發(fā)病年齡提前,同時可加快認知減退的發(fā)展,目前已被認定為AD的一類遺傳標志物[3]。ApoE為血漿脂蛋白一類關鍵構成部分,可生成β-淀粉樣肽,對神經功能具維持作用。美國國家阿爾茨海默病協(xié)會在2011年發(fā)表的《美國國家阿爾茨海默病協(xié)會關于阿爾茨海默病引起的早期癥狀(輕度癡呆)的診斷標準》提出了ApoEε4等位基因是唯一被廣泛接受的可以增加晚發(fā)性AD的風險遺傳因素,而ε2等位基因降低患病風險。《中國癡呆與認知障礙診治指南(2015年版)》指南中指出：ApoEε4是晚發(fā)型AD和散發(fā)型AD的風險因子,而且與年齡相關的認知能力下降有很大關聯(lián)。ApoEε4基因型還是MCI(輕度認知功能障礙)或CIND(非癡呆性認知功能損害)演變?yōu)锳D的風險因子。診斷推薦認為應測定ApoE基因型,可通過APOEε4基因分型測定來劃分MCI患者的危險等級,評估其演變?yōu)锳D的風險(B級推薦)?！吨袊柎暮Ｄ∨R床前期主觀認知下降診斷流程與規(guī)范專家共識 》中SCD(主觀認知下降)的診斷流程與規(guī)范中明確要進行ApoE基因檢測,ApoE分子分型有助于發(fā)現(xiàn)SCD、MCI等AD 臨床前期患者。因此ApoE基因分型檢查的普及勢必會將預防端口前移,延緩AD的發(fā)病甚至降低其發(fā)病率。我國目前只有5張ApoE基因分型試劑盒注冊證,且僅少量臨床及體檢機構開展了關于ApoE基因分型的檢測項目。

2.2 β-淀粉樣蛋白 在水解淀粉樣前體蛋白(APP)作用下,β-與γ-分泌酶可產生β-淀粉樣蛋白(Aβ)。此類多肽在諸多細胞內皆有分布,同時可見于血液、腦脊液(CSF)與腦間質液內。Aβ最廣泛的亞型是Aβ40、42,后者具備神經毒性,和AD的形成進行存在聯(lián)系。其大部分生成自小膠質細胞與星形膠質細胞,存在疏水性特點,同時在斑塊形成中起主要作用[4]。

通常認為CSF內的 Aβ42是 AD 的生物標志物,同時有助于診斷臨床前期 AD。腦脊液中較低水平Aβ42與大腦中較高的Aβ斑塊存在關聯(lián),與正常對照組相比,AD患者腦脊液中Aβ42的濃度水平顯著降低[5]。目前,腦脊液中Aβ42的檢測可以采用免疫技術或質譜法進行。但Aβ42檢測AD的特異性有待提高,有研究顯示可采用Aβ42/Aβ40的比值來判斷疾病早期階段大腦中的淀粉樣蛋白沉積,這種方法的特異性顯著優(yōu)于單獨測定Aβ42[6]。 然而腦脊液的檢測是有創(chuàng)的,不利于早期的篩查,目前越來越多的學者開始探索血液的生物標志物。Aβ蛋白可在血漿中測量,但血漿中Aβ濃度會受到血小板等因素的影響[7],與AD的相關性不及腦脊液中的Aβ濃度[5]。但令人欣喜的是,研究表明,采用質譜方法檢測血漿中Aβ濃度可呈現(xiàn)與腦淀粉樣變性之間的顯著相關性[8]。所以,挖掘有效性更高的測定技術,為突破血液篩查的核心。

2.3 Tau 微管系統(tǒng)為神經細胞骨架成分,其構成含微管蛋白(tubulin)與微管相關蛋白,后者含量較高的是 Tau蛋白。Tau蛋白的主要作用為結合微管蛋白,同時促進微管的產生[9], 若Tau過度磷酸化可聚集于細胞中,傷及微管機能,同時破壞神經細胞細胞骨架或軸突運輸,由此引發(fā)神經元變性。通常認為總-tau(T-tau)和磷酸化-Tau(P-tau)濃度與AD相關。T-tau的升高反映了神經元和軸突的退化和損傷程度[10]。P-tau的高水平提示神經纖維纏結的形成[11]。

CSF P-tau被視為AD 最具特異性的標志物,AD患者CSF的P-tau濃度會顯著增加。有研究顯示P-tau 蛋白可用于判斷MCI向AD的轉化[12],因此可作為早期臨床診斷的關鍵標志物?，F(xiàn)今可通過ELISA等免疫手段,對CSF內P-tau水平展開測定。血液中P-tau的檢測也是當前研究的熱點,但與Aβ蛋白一樣,血液篩查的技術還有待進一步提升,我國已批準六張“人磷酸化tau-181蛋白測試試劑盒”注冊證,試劑盒用于檢測血液中的P-tau的濃度,但僅能為臨床診斷提供輔助依據(jù)。學者們也試圖改進檢測方法探尋提升血液篩查的準確性和靈敏度,有探究報道了可在血源性神經元衍生的外泌體中檢測到 P-tau 濃度增加[13]。在該測定中,使用針對富含神經元的蛋白質的抗體從血清中分離外泌體。然后洗滌和裂解分離的外泌體,并使用免疫化學測定法測量它們的 tau 含量。盡管這是一項新技術,但是該技術在檢測血液中P-tau方面具有很好的前景。

2.4 神經絲輕質多肽(NFL) NFL是由NEFL基因編碼的肽,是一種內在的細胞骨架蛋白,可作為軸突損傷的生物標志物,在腦脊液和血漿中均可獲得。腦間質和腦脊液中的神經元死亡后釋放出NFL,隨后進入血液[14]。NFL的血清或血漿水平與 CSF NFL 密切相關,在家族性和散發(fā)性 AD 中均表現(xiàn)為增加,其中在家族性 AD 中,患者在出現(xiàn)顯著臨床癥狀之前10年即表現(xiàn)為NFL的濃度升高[15]。因此,血漿或血清 NFL可能是 AD 和其他神經退行性疾病中神經退行性疾病的可靠血液生物標志物。

2.5 血漿膠質纖維酸性蛋白(GFAP) GFAP是一類用于星狀膠質細胞活力監(jiān)測的關鍵指標。以往的研究表明, GFAP在 AD 患者腦內[16]和 CSF[17]中均有明顯增加,提示 GFAP有可能成為AD的潛在生物標志物。Oeckl等[18]的研究顯示,AD患者血清 GFAP含量較正常對照組明顯偏高。此外有報道也提示,與正常對照組相比早發(fā)性AD患者血漿濃度明顯增高,而晚發(fā)性 AD患者血漿中GFAP濃度的增加雖然沒有早發(fā)性AD顯著,但也明顯高于正常對照組[19]。因此GFAP有望成為血液AD標志物的一員,為 AD的臨床診斷提供新的線索。

2.6 神經顆粒蛋白(Neurogranin,Ng) Ng也是AD早期診斷的潛在生物標志物,通常在海馬和皮質的錐體細胞中以顆粒狀結構表達。Ng被證明與鈣/鈣調蛋白信號通路介導的突觸可塑性、突觸再生等功能有關[20]。有學者比較了AD、額顳葉癡呆、路易體癡呆、帕金森病等患者的腦脊液中神經顆粒蛋白的水平,結果表明,AD患者腦脊液中的神經顆粒素濃度顯著高于其他疾病,進一步說明腦脊液中較高的Ng蛋白濃度對AD具有特異的篩查作用[21]。

2.7 聯(lián)合篩查 目前普遍認為,單一的標志物不能滿足AD的早篩、早診要求,建立AD診斷的標志物組能更全面的反應AD的病程。有研究表明在 CSF中P-tau與 Aβ42的聯(lián)合使用可提高早期AD檢測的敏感性和特異性,P-tau與T-tau結合能較好地反映出 AD的發(fā)展過程[22],而T-tau/Aβ比率是預測 MCI向 AD轉變的最為可靠的生物指標[23]。T-tau和淀粉樣蛋白在 AD的診斷中具有一定的應用價值,但在 AD的鑒別中缺少特異性。在預測 MCI演變?yōu)锳D的方面,P-tau蛋白發(fā)揮著重要作用。P-tau、T-tau、Aβ42在AD的早期診斷中發(fā)揮著不同的作用,但聯(lián)合使用3種標志物會顯著提高AD的早期診斷的準確性,更好的預測MCI向 AD的階段,有利于預防和早期篩查[24]。此外,NFL、GFAP、Ng等不斷發(fā)現(xiàn)的新的標志物也應加入到AD的標志物組中,建立完善的標志物組合,才能有效推動AD的早期診斷。

3 潛在的生物標志物

3.1 炎性因子 AD 的潛在生物標志物除了可用于標志神經退行性病變。AD中的全身性炎癥可能會加劇神經功能缺損,炎性分子可促進血腦屏障的通透性,近幾年有關AD患者外周炎性因子濃度變化的研究也成為另一熱點,其中AD患者外周血中IL-1家族細胞因子濃度大多升高[25]。與正常對照組相比,AD 患者CCL2 蛋白在血清和腦脊液中也呈現(xiàn)升高的趨勢[26]。AD 患者的血清與CSF存在相關趨化因子(諸如CXCL8、CXCL9等)水平上調表現(xiàn)[27]。

3.2 代謝組學 隨著核磁共振和質譜的快速發(fā)展以及高效液相/氣相色譜技術的成熟,目前已實現(xiàn)對數(shù)千種代謝物進行動態(tài)評估,反映基因組、轉錄組和蛋白質組下游變化的功能網(wǎng)絡。Greenberg 等[28]報道了血漿中的代謝變化,證明了AD患者中甘油磷酸膽堿和d-氨基葡萄糖與對照組存在顯著差異。Oreeim等[29]對比了2年內從MCI進展為AD以及未進展為AD的人群的代謝物表達情況,可顯著觀察到2組人群存在代謝物的表達差異,特別是由 2,4-二羥基丁酸驅動的代謝物。Trushina 與Mielke經由研究發(fā)現(xiàn),在β-丙氨酸(Ala)、膽汁酸(BA)、天冬氨酸(Asp)與天冬酰胺、賴氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Lys)、L-半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)-Cys-谷氨酸(Glu)、L-Met的生物合成與代謝方面,對照組與AD有顯著不同[30]。此外心血管疾病和 AD 之間也存在一定的關聯(lián)性[31],血脂評估已成為尋找基于血液的 AD生物標志物的另一個熱門領域。

3.3 miRNA miRNAs,即MicroRNAs,屬于內源性單鏈非編碼小分子RNA,作用為調節(jié)基因表達。目前認為 miRNA 可在脂質體、高密度脂蛋白(HDL)、外泌體和一些蛋白質中進行運輸,保護 miRNA 不被降解。Leidinger等[32]報道了一組共12種miRNA,能夠以 93% 的準確度將 AD 與對照區(qū)分開來。同時這組miRNA可以有效區(qū)分AD患者與MCI、多發(fā)性硬化癥、帕金森癥、重度抑郁癥、精神分裂癥和雙相情感障礙患者,其準確率為74%～78%[33]。Nagaraj 等[34]最近對作為 AD 生物標志物的miRNA 進行了回顧,他們在文獻中報告了 136種miRNA 在 AD 和對照狀態(tài)之間發(fā)生顯著變化。在這136種 miRNA 中,有36 種經過獨立驗證并在兩個或更多個文獻中被報道,其中 hsa-miR-125b被6次證明與AD相關。

3.4 外泌體 外泌體為腦中各類細胞(含星形膠質細胞、神經元與小膠質細胞)產生的一類細胞外囊泡(EV),在不同細胞的通訊方面發(fā)揮關鍵作用。在中樞神經系統(tǒng)(CNS)中,外泌體不僅在細胞內的短距離范圍內傳播信號,而且還通過腦脊液(CSF)在整個大腦中傳播,甚至還可穿越血腦屏障在外周血中進行檢測[35]。多項研究表明血液中星形膠質細胞外泌體可作為AD早期診斷的生物標志物[36]。AD 患者血漿神經元外泌體中p-S396-tau、p-T181-tau 和 Aβ42 的水平顯著高于對照組,與CSF 中的濃度存在相關性[13]。因此,通過檢測外泌體中Aβ42、T-tau 和P-tau用于早期AD的診斷而非有創(chuàng)的CSF檢測成為可能。

3.5 甲酸 Wang等[37]測試了一大批患有不同嚴重程度AD的患者和認知能力正常的健康對照組,以確定尿液生物標志物的差異,研究發(fā)現(xiàn),與健康對照組(包括早期 SCD 組)相比,所有AD患者的尿甲酸水平都顯著升高,并與認知能力下降相關。如此可見甲酸作為早期AD的生物標志物具敏感性。當研究人員結合基于血液的AD生物標志物分析尿液中的甲酸水平時,發(fā)現(xiàn)它們可以更準確地預測患者所處的疾病階段。因此甲酸有望成為新的診斷標志物。

3.6 凝溶膠蛋白(gelsolin) Jiang等[38]研究認為GSN為AD的風險基因,研究人員利用全基因組測序在AD病例-對照隊列(1 192例AD患者和1403例對照)中進行罕見變異分析,發(fā)現(xiàn)GSN基因移碼突變在AD患者(0.50%,6/1 192)中占比較高;隨后在驗證隊列中進行GSN靶向測序,發(fā)現(xiàn)AD患者中GSN移碼突變頻率高達1.47%。GSN基因編碼凝溶膠蛋白(gelsolin),是一種鈣調控的肌動蛋白調節(jié)蛋白,參與炎癥、細胞活性、凋亡和癌癥發(fā)生等多個生理過程。為明確攜帶GSN移碼突變患者的臨床診斷,團隊對部分患者完成了Aβ-PET、皮膚活檢等檢測,證實了攜帶GSN移碼突變患者為AD表型,認為GSN為AD新的風險基因。進一步的研究表明,GSN移碼突變可降低Aβ42水平、抑制Aβ誘導毒性和保護細胞凋亡的功能喪失。為進一步探索gelsolin能否作為AD早期診斷標志物,團隊還發(fā)現(xiàn)AD患者血漿和腦脊液中gelsolin水平顯著高于對照,與腦脊液中Aβ42水平呈正相關;且gelsolin蛋白水平隨病程和認知功能下降呈先升高后降低的趨勢,提示血漿gelsolin蛋白的升高可能是AD的代償反應,有望成為AD新的生物標志物。

AD在老年群體中的患病人數(shù)逐年攀升。在我國≥65歲老年人中,每20人中就有1人患AD,≥85歲的4位老人就有1人患病[1]。AD屬于一類進行性慢性神經退行性病變,表現(xiàn)以記憶力下降、行為異常、思維能力減退等為主。由于AD的慢性進行性特點,一旦發(fā)病,患者的生活質量將極大降低,也給家庭帶來很大的負擔。所以,早期診治AD非常關鍵。生物標志物目前認為是可以作為AD早期診斷的重要手段,如通過分析PSEN1、PSEN2、APP、APOE等基因的突變和基因分型的情況,預測分析AD的病程。腦脊液Aβ1-42、T-tau 和 p-tau的濃度對AD的診斷具有重要的意義,然而腦脊液采樣方法的侵入性限制了其在臨床實踐中的傳播和應用。與腦脊液標記物相比,血液標志物獲取容易,創(chuàng)傷小,操作簡單等優(yōu)勢則更適合AD的早期篩查和診斷。但目前仍沒有十分理想的AD標志物,學者們開始探尋新的出路,想通過炎性因子、代謝組學、miRNA、外泌體等多種途徑找到最合適的生物標志物。隨著研究的逐漸深入,學者們也普遍認為,建立AD的標志物組來進行聯(lián)合診斷的方式才能有效追蹤AD的發(fā)生發(fā)展過程。未來如何建立合適的標志物組合將會成為AD早期篩查的研究熱點,只有突破這一技術壁壘才有望實現(xiàn)早診斷、早預防、早治療、最大程度的降低疾病造成的損害。