王可欣,郭昭陽,殷宇航,陳勝忠,宋希云,趙美愛,

(1.青島市主要農作物種質創(chuàng)新與應用重點實驗室,青島農業(yè)大學 農學院,山東 青島 266109;2.青島農業(yè)大學 生命科學學院,山東 青島 266109)

我國作為傳統(tǒng)農業(yè)大國,人口基數大,糧食問題一直備受關注。玉米(ZeamaysL.)是我國第一大糧食作物,在農業(yè)生產和糧食安全中發(fā)揮重要作用,但在生長過程中經常遭遇干旱、鹽堿、高溫、低溫等非生物脅迫,導致減產和品質的降低[1],其中鹽堿地土壤所含的鹽分嚴重影響作物的正常生長。我國鹽堿地的面積約為9 913萬hm2,開發(fā)利用價值巨大,已被開墾利用的鹽堿地還未達到其總面積的五分之一[2]。合理利用鹽堿地不僅可以緩解我國地少人多的局面,還可以在很大程度上緩解糧食供不應求的現(xiàn)狀。鹽堿地治理難度較大,進行耐鹽基因的挖掘和耐鹽堿新品種的培育是可行的治理措施之一。

谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)是一個古老且具有多種作用的蛋白質超家族[3],可以調控植物的生長發(fā)育并在初生代謝、次生代謝、細胞信號轉導以及對抗生物和非生物脅迫[3]等生物學過程中發(fā)揮重要作用[4]。GSTs分為4個主要的蛋白質家族,細胞質GSTs、線粒體GSTs、微粒體GSTs和細菌磷霉素抗性蛋白,其中細胞質GST家族是最豐富的[5]。在植物中,GST可分為6 類,包括Phi(F)、Tau(U)、Lambda(L)、Theta(T)、Zeta(Z)和脫氫抗壞血酸還原酶(Dehydroascorbate reductases,DHARs),其中Phi(F)和Tau(U)是最大植物特異性和高度應激誘導的谷胱甘肽轉移酶基因種類[6]。根據 GST 蛋白序列構建的隱馬爾可夫模型,鑒定出玉米基因組中一共含有37個ZmGST基因,可分為U、F、Z 3種[7]。U型 GST基因的表達與細胞分裂素、生長素等激素有關,對植物的生長發(fā)育起著調節(jié)作用[8]。

GST基因在逆境脅迫中扮演著重要角色,包括調控植物非生物脅迫過程[9]。如AtGSTU17通過作為脅迫介導的信號轉導途徑的負成分在干旱和鹽脅迫的適應性響應中發(fā)揮作用[10],在煙草幼苗中過表達GST基因,增加了谷胱甘肽依賴性的過氧化物的清除和谷胱甘肽、抗壞血酸代謝的改變,從而減少了氧化損傷[11]。番茄相關GST基因LeGSTU2在根和花中表達,進行擬南芥異源驗證獲取的轉基因植物對NaCl和甘露醇誘導的鹽和滲透脅迫的抵抗力增強[12]。玉米ZmGST23基因的表達顯著受干旱、鹽、低溫等非生物脅迫的誘導[4]。

GST的作用是通過與谷胱甘肽的結合來解除有毒物質,減輕氧化應激反應[13-14]。鹽脅迫會導致植物失水使?jié)B透壓改變,體內活性氧代謝系統(tǒng)會出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象,并產生大量活性氧,從而損傷植物質膜和其他細胞組分,進而影響植物的生長發(fā)育[15]。GST基因在植物的抗氧化過程中具有十分重要的作用[16],于是推測鹽脅迫下過量表達玉米ZmGST基因能在一定程度上減緩對植物的損傷。GST基因除了抗逆相關功能,還有一些其他生物作用,主要包括清除體內的毒性代謝產物[17-18]并且參與到信號傳遞中[19]。功能多樣化的GST在研究基因家族進化方面具有重要意義,并為研究其在植物發(fā)育和對環(huán)境信號的響應中的作用開辟了途徑[20]。

本試驗對ZmGST進行克隆和生物信息學分析。通過實時熒光定量PCR探究ZmGST組織特異性表達以及干旱和鹽脅迫下的基因表達量。ZmGST轉入原核載體pET28a并通過pET28a-ZmGST大腸桿菌研究該基因對鹽脅迫、干旱非生物脅迫的作用,為該基因轉入真核表達載體提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗使用的玉米自交系CA66由玉米分子育種實驗室提供。選取飽滿的玉米種子種植于營養(yǎng)土中,三葉期時取樣。

脅迫處理:使用0.2 mol/L的NaCl以及20% PEG6000處理CA66三葉期玉米,并對根進行分時段取樣,分別是0,12,24,36 h,于-80 ℃保存。每個試驗組3個重復。

1.2 試驗方法

1.2.1ZmGST的克隆和原核表達載體構建 根據NCBI(National Center for Biotechnology Information (nih.gov))中參考序列的CDS全長進行特異性引物設計,見表1引物1。以根的cDNA作為模板進行PCR擴增后連接中間載體pMD19-T,將菌液PCR以及雙酶切驗證后檢測得到的陽性克隆送青島擎科生物公司測序,測序正確的菌液提取質粒pMD19-T-ZmGST后存于-80 ℃。pET28a菌株由本實驗室保存,使用pMD19-T-ZmGST質粒作為模板進行PCR擴增,引物見表1引物2,使用T4連接酶配置pET28a-ZmGST連接體系。將菌液PCR驗證后檢測得到的陽性克隆送青島擎科生物公司測序。具體步驟參照參考文獻[21]。

表1 玉米ZmGST基因所用引物

1.2.2 ZmGST蛋白特性分析 通過NCBI網站的Blast功能,分析該基因的CD-Search保守區(qū)。ProtParam軟件進行生物信息學分析,ProtScale在線軟件對蛋白質序列進行親水性、疏水性的預測分析,TMHMM 2.0對蛋白質序列跨膜結構預測分析,NetPhos 3.1軟件分析ZmGST蛋白的磷酸化位點,SingalP 4.1預測信號肽,Psort Prediction進行亞細胞定位預測,SoPMA分析ZmGST蛋白二級結構,SWISS-MODEL分析三級結構,PlantCARE分析啟動子區(qū)域元件。

1.2.3ZmGST基因的組織特異性表達分析 玉米自交系CA66正常生長至三葉期,取根、莖、葉樣品至液氮中保存,根據TaKaRa試劑盒提取RNA,利用超微量分光光度計檢測RNA濃度。反轉錄合成cDNA,通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)進行組織特異性表達分析。引物設計見表1引物3,以玉米Actin作為內參基因,基因號為LOC100282267。

1.2.4 實時熒光定量PCR 將0.2 mol/L的NaCl以及20% PEG6000處理后的玉米取樣后進行實時熒光定量PCR。反應程序為:預變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 10 s,退火55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,循環(huán)數35。釆用2-ΔΔCt相對定量的分析方法進行數據分析,使用SPSS軟件進行數據差異性分析。

1.2.5 pET28a-ZmGST重組大腸桿菌的鹽、干旱脅迫處理 鹽脅迫:配置NaCl濃度為0.6,0.8,1.0 mol/L的LB液體培養(yǎng)基并在高溫滅菌后,將pET28a空載和pET28a-ZmGST的大腸桿菌分別在超凈工作臺中接種至上述3種濃度的NaCl培養(yǎng)基中,37 ℃搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng),每隔1 h取樣測定吸光度并進行處理與分析。

干旱脅迫:本試驗使用PEG6000模擬植物干旱條件,配置PEG6000濃度為5%,10%,15%的LB液體培養(yǎng)基,后續(xù)試驗步驟同鹽脅迫。

2 結果與分析

2.1 谷胱甘肽-S-轉移酶ZmGST的克隆

以玉米CA66根、莖、葉cDNA為模板進行PCR擴增可知,ZmGST在根、莖、葉中均能擴增(圖1-A),條帶大小為384 bp。連接PMD19-T載體后進行菌液PCR鑒定(圖1-B),菌液擴增片段大小為384 bp,雙酶切驗證在指定位置出現(xiàn)線性化DNA條帶(圖1-C)。測序結果與已公布B73序列堿基相似性為99.65%,氨基酸序列相似度為98.43%。pMD19-T-ZmGST連接pET28a原核表達載體進行菌液PCR驗證得到正確條帶(圖1-D),測序與克隆序列比對相似度為100%。

2.2 ZmGST蛋白質特性分析

2.2.1 ZmGST蛋白質的理化特性ZmGST堿基序列以及蛋白質如圖2-A所示,編碼384 個核苷酸,127 個氨基酸。使用ProtParam軟件進行生物信息學預測分析,表明ZmGST編碼的蛋白質分子式為C654H1003N175O189S4,相對分子量為14.47 ku,理論等電點5.06,總負電荷殘基數(Asp+Glu)為20,正電荷殘基總數(Arg+Lys)為16,不穩(wěn)定指數為46.75,屬于不穩(wěn)定蛋白質。通過NCBI網站的Blast功能,進行該基因的CD-Search保守區(qū)分析(圖2-B),發(fā)現(xiàn)克隆的CDS蛋白內存在一個GST_C結構域,屬于Tau(U)這一分支,是植物抗氧化系統(tǒng)的重要成員,可能在逆境響應等生物學過程中發(fā)揮重要作用[3],該基因包含2個外顯子(圖2-C)。

A.核苷酸及氨基酸序列;B.保守域分析;C.ZmGST基因結構分析。

利用 ProtScale在線軟件對ZmGST蛋白質序列進行親水性、疏水性預測分析,親水性蛋白多于疏水性蛋白,該蛋白屬于親水性蛋白(圖3-A)。TMHMM 2.0對蛋白質序列跨膜結構預測分析,其氨基酸序列中不存在跨膜結構(圖3-B),可直接進行原核表達的驗證。采用NetPhos 3.1修飾位點進行分析發(fā)現(xiàn),ZmGST存在12 個磷酸化修飾位點(圖3-C),其中Thr(蘇氨酸)有4 個、Ser(絲氨酸)4 個、Tyr(酪氨酸)4 個,磷酸化修飾位點較為均等,可能與信號轉導、生長發(fā)育等有關。使用SignalP 4.1對ZmGST蛋白進行信號肽預測分析(圖3-D),未發(fā)現(xiàn)有信號肽,為非分泌型蛋白。Psort Prediction進行亞細胞定位預測,定位在細胞核里的可能性最大為34.8%,胞質為30.4%,線粒體為21.7%,最小的是細胞外(包括細胞壁)是4.3%。

A.疏水親水分析;B.跨膜結構分析;C.磷酸化預測;D.信號肽預測。

2.2.2 ZmGST蛋白結構預測 通過SoPMA分析ZmGST蛋白二級結構,如圖4-A所示,二級結構依次為α螺旋(藍色)占62.2%、β-折疊(綠色)占7.09%、無規(guī)則卷曲(紫色)占17.32%和延伸鏈(紅色)占13.39%。再通過SWISS-MODEL進一步分析三級結構如圖4-B所示,發(fā)現(xiàn)同樣存在多個α螺旋與無規(guī)則卷曲,與二級結構分析一致,α螺旋為主要元件。

圖4 ZmGST蛋白二級結構直觀圖與空間結構

2.2.3ZmGST以及玉米GST家族系統(tǒng)進化樹 為了解ZmGST蛋白與不同物種的親緣關系,將獲得的氨基酸序列在NCBI上進行Protein Blast,得到的序列進行系統(tǒng)進化樹分析(圖5),該基因ZmGST與高粱(Sorghumbicolor)的親緣關系最近。對玉米GST基因家族進行系統(tǒng)進化樹分析,利用李曉玉等[7]對玉米GST家族的建立隱馬爾可夫模型(Hidden markov model,HMM)的方法分析,將玉米GST基因根據序列相似性分為U型(藍色區(qū)域)、F型(紫色區(qū)域)、Z型(橙色區(qū)域)三類(圖6)。利用DNAMAN與這些序列對比發(fā)現(xiàn)ZmGSTU14與克隆的ZmGST基因的全長氨基酸相似度最高為82.46%(紅色),屬于U型。

圖5 ZmGST的系統(tǒng)進化樹

圖6 玉米GST家族系統(tǒng)進化樹

2.2.4ZmGST基因啟動子分析 利用PlantCARE對啟動子區(qū)域進行元件分析,ZmGST基因啟動子區(qū)(圖7)含有多個響應逆境及植物激素的作用元件,包括LTR參與低溫反應原件、TC-rich repeats參與防御和應激反應元件、ABRE與脫落酸反應相關元件以及G-box光響應元件,推測基因被鹽脅迫誘導可能與TC-rich repeats元件相關。

圖7 ZmGST啟動子元件分析

2.3 ZmGST的組織特異性表達分析

實時熒光定量PCR對玉米不同組織(根、莖、葉)中的基因表達特異性分析結果顯示,ZmGST在不同組織中均有表達,相對表達量在根中最高,其次為葉和莖(圖8-A)。根部表達量約為莖的5 倍,葉的2.5倍,說明ZmGST主要在根中發(fā)揮作用。脅迫處理后的相對表達量結果顯示(圖8-B),在模擬干旱條件下ZmGST基因下調表達,12～36 h表達量降低,在24 h最低。鹽處理后該基因的表達量呈上升趨勢,在24 h的基因表達量是0 h的3倍。因此,推測ZmGST在干旱脅迫時受到抑制,在鹽脅迫處理時被誘導,表明該基因可能對這兩個逆境脅迫存在不同作用。

A.ZmGST的組織特異性分析;B.ZmGST 受到脅迫后的表達量分析(0,12,24,36 h)。不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。

2.4 ZmGST基因耐鹽功能分析

成功構建重組大腸桿菌DH5α(pET28a-ZmGST)后,對pET28a-ZmGST以及pET28a進行不同濃度鹽脅迫,測得平均OD600如圖9所示,轉入了重組質粒pET28a-ZmGST的菌體生長情況高于轉入空載體pET28a的菌體,說明對照菌體pET28a在0.6,0.8,1.0 mol/L鹽濃度培養(yǎng)基中菌體的生長明顯受到了抑制,而轉入重組質粒pET28a-ZmGST的大腸桿菌菌體在0.6,0.8,1.0 mol/L鹽濃度的培養(yǎng)基中均能正常生長,ZmGST基因在原核水平內可能對鹽脅迫有一定的抗性,與鹽脅迫玉米后該基因上調表達結果一致。

圖9 鹽處理后pET28a-ZmGST菌株、pET28a菌株生長曲線圖

2.5 ZmGST基因耐旱功能分析

成功構建重組大腸桿菌DH5α(pET28a-ZmGST)后,對pET28a-ZmGST以及pET28a進行PEG6000的不同濃度干旱脅迫,測得平均OD600如圖10所示,轉入了重組質粒pET28a-ZmGST的菌體在5%,10%中與空載體pET28a的菌體生長情況一致,均明顯受到抑制,在15%PEG6000中高于空載菌體生長狀況,但趨勢較為相似,推測該基因對干旱敏感。

圖10 干旱處理后的pET28a-ZmGST菌株、pET28a菌株生長曲線圖

3 結論與討論

谷胱甘肽-S-轉移酶家族成員眾多,存在于各種植物中,在擬南芥[10]、水稻[22]、小麥[23]、玉米[24]等均有研究。在GST家族中,植物特有的是Phi、Tau、Lambda和DHAR類,其中U型是二聚體的,可以催化各種生物的結合,在除草劑中具有選擇性解毒的作用[25]。U型是玉米谷胱甘肽轉移酶成員最多的一類。同樣地,本試驗克隆了U型的玉米GST類基因中的一種,通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),ZmGST蛋白相對分子量是14.47 ku,為不穩(wěn)定的親水蛋白,未發(fā)現(xiàn)信號肽,不存在跨膜結構域,同樣符合該基因在細胞核的預測。通過分析其表達量,利用ePlant網站得到該基因在根中表達水平最大值約是在葉中表達水平最大值的100 倍且表達最大值在根毛附近,無根毛區(qū)域表達量較根毛區(qū)域表達量相差較大。表達差異結果與實時熒光定量結果相符,在根中表達量最大。系統(tǒng)進化樹分析與高粱的親緣關系最近,在玉米GST家族中與ZmGSTU14相似度最高。

U類GST基因在逆境脅迫中發(fā)揮作用。水稻GST基因OsGSTU3和OsGSTU4編碼Tau類谷胱甘肽S-轉移酶,響應水稻根系缺氧脅迫誘導以及鹽脅迫[16]。GST還通過在各種生物或非生物脅迫下過量表達,來增強植物對逆境的抵抗力,是抗氧化防御系統(tǒng)中重要的酶系[26-28]。如大豆GmGSTU2是Tau類谷胱甘肽轉移酶家族基因,通過增強谷胱甘肽轉移酶的活性介導活性氧和谷胱甘肽的清除,從而增強植物對鹽脅迫的耐受性[29]。柳樹ThGSTZ1的過表達通過增強清除活性氧的能力來改善干旱和耐鹽性[30]。這些與ZmGST響應鹽脅迫的功能類似,但是其作用機理仍需探究,可見GST基因研究具有重要意義。

玉米在生長過程經常會遇到干旱、鹽、低溫等非生物脅迫,可引起玉米不同程度的脫水,從而引起滲透脅迫,使得ABA濃度急劇上升,從而誘發(fā)大量的活性氧(ROS)的生成。ROS還可以起到誘導植物抵抗逆境的作用,但過量的ROS會使生物大分子如膜脂、核酸、蛋白質等發(fā)生一定損傷,從而引起二次脅迫[31]。GST的主要功能是通過促進親電性底物與GSH發(fā)生反應,從而實現(xiàn)對活性氧和外來物質的清除,谷胱甘肽硫轉酶能使GSH的巰基與某些親電子性化合物相結合,對DNA和某些蛋白的損害有一定的保護作用,GST能將疏水性較強的外源性與內源性的代謝物進行代謝并提高它們的極性,最后排出體外[27],從而保證植物正常的生長發(fā)育。因此推斷GST作為一類與活性氧有關的酶,可能與ROS相關。

為了研究ZmGST基因是否對脅迫產生響應,熒光定量結果顯示在鹽脅迫條件下該基因表達上調。通過原核表達試驗證明,重組質粒pET28a-ZmGST的大腸桿菌菌體在不同鹽濃度的培養(yǎng)基中均能正常生長,因此,推測該基因可能與耐鹽作用相關,也可能與ROS相關。進一步探究干旱敏感作用機理對于深入研究ZmGST基因功能和真核生物中的作用具有參考價值,同時也揭示了該基因在玉米逆境脅迫下反應機制至關重要。