陳一笑，王威宇，馮建有，秦雪梅，高曉霞*

? 藥理與臨床 ?

基于分子生物學及代謝組學的柴胡注射液抗肝癌作用機制研究

陳一笑1, 2, 3，王威宇1, 2, 3，馮建有1, 2, 3，秦雪梅1, 2, 3，高曉霞1, 2, 3*

1. 山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006 2. 山西大學 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006 3. 地產(chǎn)中藥功效物質研究與利用山西省重點實驗室，山西 太原 030006

探究柴胡注射液抑制肝癌細胞增殖及誘導其凋亡的作用與機制。體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細胞與人正常肝細胞（LO-2），給予不同質量濃度的柴胡注射液干預，MTT法與劃痕實驗檢測細胞增殖和遷移；采用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡；采用qRT-PCR及Western blotting技術檢測與周期阻滯、凋亡及遷移相關的基因與蛋白表達；代謝組學技術檢測柴胡注射液干預前后肝癌細胞內(nèi)源性差異物的變化，采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析柴胡注射液調(diào)節(jié)的代謝通路。柴胡注射液（100～450 mg/mL）顯著抑制肝癌細胞增殖（＜0.01、0.001），使細胞阻滯于S期與G2期（＜0.05），促進肝癌細胞凋亡（＜0.001），抑制肝癌細胞遷移（＜0.05、0.001），表明柴胡注射液具有顯著的抗肝癌作用。柴胡注射液顯著降低肝癌細胞中神經(jīng)元PAS結構域蛋白2（neuronal pas domain protein 2，）、細胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A，）、周期蛋白依賴激酶2（cyclin-dependent kinase 2，）、細胞周期蛋白A（）、、、mRNA表達（＜0.01、0.001），下調(diào)NPAS2、CDC25A、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達（＜0.001），上調(diào)Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）蛋白表達（＜0.01、0.001）。代謝組學結果顯示，柴胡注射液干預核苷酸代謝、脂質代謝途徑、糖酵解途徑、氨基酸代謝途徑、脂肪酸代謝途徑等。柴胡注射液對SMMC-7721細胞有阻滯及促凋亡的作用，其可能的機制為下調(diào)NPAS2-CDC25A使細胞阻滯于S期，下調(diào)CDC25B、CDK1、cyclin B1使細胞處于G2期阻滯，下調(diào)MMP-9/TIMP-1值抑制肝癌細胞遷移，調(diào)節(jié)核苷酸、脂質與氨基酸代謝等通路，從而誘導肝癌細胞凋亡。

柴胡注射液；肝癌；凋亡；細胞周期；遷移；代謝組學

肝癌為臨床上常見的惡性腫瘤，具有前期不易診斷、晚期致死率高等特點，嚴重威脅到患者的生命。由于肝腫瘤解剖部位特殊，因此外科通常以介入和手術治療為主，中西醫(yī)結合治療也是其重要的治療手段之一。柴胡是傘形科植物柴胡DC.或狹葉柴胡Willd.的干燥根，具有疏散退熱、疏肝解郁的功效[1]。柴胡對于肝臟性疾病，如肝纖維化、肝癌等療效顯著，臨床上將柴胡疏肝化瘀方與侖伐替尼聯(lián)合治療原發(fā)性肝癌取得較佳的治療效果[2]。研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D可以通過促進細胞自噬及線粒體功能，促進有機陰離子轉運多肽（organic aniontransporting polypeptide 1B1，Oatp1b1）表達，減少細胞外基質沉積，從而對阿霉素治療小鼠肝癌具有靶向導引作用[3]。柴胡注射液是柴胡經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液[4]；臨床上將肝動脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）與柴胡注射液配合治療肝癌取得較好的療效[5-7]；相關藥理實驗也表明柴胡注射液具有體外抑制肝癌增殖的活性[8-9]。柴胡復方和柴胡制劑都表現(xiàn)出抑制肝癌增殖、促進肝癌細胞凋亡的效果，然而柴胡注射液的抗肝癌作用機制并未有明確的研究。

腫瘤是一種與節(jié)律相關的疾病，在許多腫瘤研究中均有報道[10-12]。神經(jīng)元PAS結構域蛋白2（neuronal pas domain protein 2，NPAS2）是產(chǎn)生和維持周期節(jié)律的重要調(diào)控因子，惡性腫瘤的發(fā)生與其異常表達有關[13]。NPAS2作為晝夜節(jié)律生物系統(tǒng)中的重要核心組件，可以調(diào)控多種與周期相關基因的轉錄，進而影響肝癌細胞的增殖[14]。隨著癌癥惡性增殖機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白依賴激酶（cyclin dependent kinase，CDKs）與細胞周期蛋白（cyclins）組成的蛋白復合物（CDKs-cyclins）在調(diào)控癌癥細胞進程中發(fā)揮著重大作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)cyclin E調(diào)控細胞G1/S期進程，進入S期后略微下降[16]。

代謝組學是借助色譜、質譜及液質聯(lián)用等技術對生物體內(nèi)的代謝物進行定量分析，進而解釋復雜性病理或生理變化的方法[17]。由于肝癌的發(fā)生發(fā)展與機體的代謝狀態(tài)密切相關，因此檢測差異代謝物的變化可以更好把握肝癌的發(fā)展階段和惡化狀態(tài)，這有利于臨床早期肝癌的診斷。本研究以人肝癌SMMC-7721細胞及人正常肝細胞（LO-2）為對象，采用分子生物學與代謝組學的方法，來探討柴胡注射液的抗肝癌作用與機制，從而在分子層面及代謝方面對柴胡注射液的抗肝癌機制有更深入的認識，為臨床肝癌治療提供理論基礎。

1 材料

1.1 細胞

SMMC-7721細胞和LO-2細胞均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

柴胡注射液（1 g/mL，批號Z20073102）購自輔仁藥業(yè)；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號E709FA0003）購自上海生物工程股份有限公司；0.25%胰酶（批號13F09A67）購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（批號20170621）購自天杭生物科技股份有限公司；MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司；分析級石油醚、醋酸乙酯購自北京化工試劑；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）購自北京北大藥業(yè)；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號PAB180007）購自Bioswamp公司；SYBR Green PCR試劑盒（批號KM4101）購自Kapa Biosystem公司；逆轉錄試劑盒（批號639505）購自日本Takara公司；NPAS2抗體（批號H00004862-D01）、細胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A，CDC25A）抗體（批號PAB0425）購自Abnova公司；基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體（批號HPA001238）購自美國Sigma-Aldrich公司；基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）抗體批號orb1248799）、細胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗體（批號orb804756）購自Biorbyt公司、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號AB112）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號AG1208）購自Beyotime公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號ab49822）購自英國Abcam公司；HRP標記的羊抗兔二抗（貨號20536-1-AP）購自上海生工生物工程有限公司；抗體β-actin（貨號20536-1-AP）；無水乙醇（批號10009218）、氯仿（批號10006818）、異丙醇（批號80109218）購自國藥集團有限公司；乙腈、甲酸（質譜級）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

Infinite M200 Pro型酶標儀（瑞士Tecan公司）；Neofuge 1600R/1600型低溫離心機（力康集團）；D180型細胞培養(yǎng)箱（瑞沃德生命科技有限公司）；NovoCyte型流式細胞分析儀（ACEA公司）；EPS300r型電泳儀、5200型化學發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）；Q Exactive UPLC-MS型超高效液相色譜與質譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

SMMC-7721和LO-2細胞用含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測SMMC-7721和LO-2細胞增殖

SMMC-7721和LO-2細胞分別以1×105個/mL接種于96孔板中，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h使細胞貼壁后，設置對照組、5-FU（25 μg/mL）組和柴胡注射液（以生藥量計50、100、200、250、350、450 mg/mL）組，每組設3個復孔；對照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組加入相應藥物，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10% MTT的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩搖勻，用酶標儀在490 nm處測定吸光度（）值。

2.3 流式細胞儀檢測SMMC-7721細胞周期及凋亡

SMMC-7721細胞以1×105個/mL接種于6孔板中，設置對照組和柴胡注射液（200、250、350 mg/mL）組，檢測細胞周期；設置對照組和柴胡注射液（200 mg/mL）組，檢測細胞凋亡。對照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組加入相應藥物，培養(yǎng)24 h，收集細胞，按照文獻方法處理[18-19]，上機檢測細胞周期與凋亡。

2.4 MTT法檢測SMMC-7721細胞遷移

SMMC-7721細胞以1×105個/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，于孔中央用200 μL槍頭垂直“一”字劃痕，用預冷的PBS緩沖液洗滌以清除細胞碎片。設置對照組和柴胡注射液（200 mg/mL）組，對照組加入培養(yǎng)基，給藥組加入藥物，分別于0、12、24、36 h觀察劃痕傷口愈合情況并拍照，用Photoshop CS4軟件“多邊形套索工具”計算劃痕面積。

2.5 qRT-PCR檢測SMMC-7721細胞NPAS2、CDC25A、CDC25B、CDK1、CDK2、cyclin A和cyclin B1 mRNA表達

SMMC-7721細胞以1×105個/mL接種于6孔板中，設置對照組和柴胡注射液（250 mg/mL）組，對照組加入培養(yǎng)基，給藥組加入藥物，培養(yǎng)24 h，收集細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

2.6 Western blotting檢測SMMC-7721細胞Bax、Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3、NPAS2、CDC25A、MMP-9和TIMP-1蛋白表達

SMMC-7721細胞以1×105個/mL接種于6孔板中，設置對照組和柴胡注射液（250 mg/mL）組，對照組加入培養(yǎng)基，給藥組加入藥物，培養(yǎng)24 h，收集細胞，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細胞，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清。BCA法進行蛋白定量，蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入二抗室溫孵育1 h，用ECL顯影，掃描條帶。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列(5’-3’)擴增片段/bp NPAS2F: GCACTAAAGGACAAGGG93 R: TGGCGAATGACTGGTAT CDC25AF: CCTTGACAACCGATGC202 R: CAGGGATAAAGACTGATGAA CDC25BF: ACAGCGAAACCCCAAAGA243 R: TGATGGCAAACTGCTCGT CDK1F: GGAACTTCGTCATCCAAATA129 R: TACTGACCAGGAGGGATAGA CDK2F: GAAACAAGTTGACGGGAGA171 R: TGATGAGGGGAAGAGGAA cyclin AF: TGGAGTTGTGCTGGCTAC216 R: TCAGGGAGTGCTTTCTTT cyclin B1F: GCACTTTCCTCCTTCTCA100 R: CGATGTGGCATACTTGTT GAPDHF: CCACTCCTCCACCTTTG106 R: CACCACCCTGTTGCTGT

2.7 代謝組學研究

2.7.1 分組及給藥處理 取8 mL SMMC-7721細胞培養(yǎng)液置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入8 mL柴胡注射液（250 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不加入藥物的SMMC-7721細胞作為模型組，不加入藥物的LO-2細胞作為正常組，每組平行6個樣本。刮取細胞，加入預冷PBS離心清洗2遍，超聲破碎細胞[20]，乙腈沉淀蛋白，低溫13 000 r/min離心15 min，取上清液轉移到干凈EP管，于真空冷凍離心干燥機干燥。以200 μL初始流動相（0.1%甲酸水溶液-乙腈＝9∶1）復溶，低溫13 000 r/min離心15 min，上清液進UPLC-MS分析。另各取上述LO-2組、SMMC-7721組、柴胡注射液組細胞樣本液20 μL混合，作為質控樣本。

2.7.2 液相條件 Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，2% B；4～5 min，2%～3% B；5～8 min，3%～15% B；8～13 min，15%～35% B；13～17 min，35%～55% B；17～23 min，55%～70% B；23～26 min，70%～80% B；26～28 min，80%～85% B；28～36 min，85%～95% B；36～38 min，95% B；38～40 min，95%～2% B；40～41 min，2% B。體積流量0.2 mL/min；進樣量5 μL；柱溫40 ℃。

2.7.3 質譜條件 采用ESI離子化方式，噴霧電壓正極3.5 kV，負極?2.5 kV；毛細管溫度320 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量35 arb；輔助氣體積流量10 arb；掃描模式為Full Scan/dd-MS2，采集范圍/100～1500，正負離子切換采集模式。分辨率采用MS Full Scan 35 000 FWHM，MS/MS 17 500 FWHM，碰撞能量為12.5、25、37.5 eV[21]。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 柴胡注射液對SMMC-7721和LO-2細胞增殖的影響

如圖1所示，柴胡注射液質量濃度為100～450 mg/mL時，顯著抑制SMMC-7721和LO-2細胞存活率（＜0.01、0.001），呈劑量相關性，且對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用較強。柴胡注射液質量濃度為250 mg/mL時達到半數(shù)抑制率（49.54%），因此選擇250 mg/mL進行后續(xù)研究。

3.2 柴胡注射液對SMMC-7721細胞周期和凋亡的影響

如圖2所示，與對照組比較，柴胡注射液（200、250、350 mg/mL）組G1期細胞比例顯著減少（＜0.05、0.01），柴胡注射液（200、350 mg/mL）組S期細胞比例顯著升高（＜0.05），柴胡注射液（250、350 mg/mL）組G2期細胞比例顯著升高（＜0.05），表明柴胡注射液阻滯肝癌細胞于S期和G2期。如圖3所示，柴胡注射液（250 mg/mL）作用于SMMC-7721細胞24 h后，肝癌細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；與對照組比較，柴胡注射液組細胞凋亡率明顯升高（＜0.001）。

與SMMC-7721細胞對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與LO-2細胞對照組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001，圖2～5同

圖2 柴胡注射液對SMMC-7721細胞周期的影響(, n = 3)

3.3 柴胡注射液對SMMC-7721細胞遷移的影響

如圖4所示，與對照組比較，柴胡注射液顯著抑制SMMC-7721細胞遷移（＜0.05、0.001），表明柴胡注射液具有抑制肝癌細胞遷移的作用。

3.4 柴胡注射液對SMMC-7721細胞周期、凋亡和遷移相關蛋白及基因表達的影響

3.4.1 細胞周期相關基因與蛋白表達 如圖5-A、B所示，與對照組比較，柴胡注射液組、、、、、、mRNA表達水平均顯著降低（＜0.01、0.001），NPAS2和CDC25A蛋白表達水平均顯著降低（＜0.001）。

3.4.2 凋亡相關蛋白表達 如圖5-C所示，與對照組比較，柴胡注射液組Bax、Bax/Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（＜0.01、0.001），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（＜0.001）。

圖3 柴胡注射液對SMMC-7721細胞凋亡的影響(, n = 3)

圖4 柴胡注射液對SMMC-7721細胞遷移的影響(, n = 3)

3.4.3 遷移相關蛋白表達 如圖5-D所示，與對照組比較，柴胡注射液組MMP-9和TIMP-1蛋白表達水平顯著升高（＜0.001），MMP-9/TIMP-1值顯著降低（＜0.01）。

3.5 代謝組學分析

3.5.1 代謝輪廓數(shù)據(jù)采集 采用UHPLC-MS對正常肝細胞、肝癌細胞、柴胡注射液組樣品進行數(shù)據(jù)采集，得到正、負離子模式下的代謝輪廓（圖6）。

3.5.2 方法學考察 為了監(jiān)測UHPLC-MS穩(wěn)定性，每6針樣品之后進一針質控樣品。每針質控樣品提取10個離子，計算6針質控樣品中該10個提取離子的保留時間以及質荷比的RSD值。如表2所示，保留時間的RSD為0.136%～0.436%，質荷比的RSD為（3.28×10?5～6.15×10?5）%，提示所建立的UHPLC-MS方法符合批量肝細胞分析要求。

圖6 正(A)、負(B)離子模式下各組樣本總離子流圖

表2 UHPLC-MS穩(wěn)定性結果

Table2 UHPLC-MS stability results

編號tR/minRSD/%m/zRSD/%離子模式 11.550.236 7147.052 96.15×10?5[M＋H]+ 22.100.315 8111.043 54.72×10?5[M＋H]+ 33.100.436 8152.033 24.82×10?5[M－H]? 45.740.426 1151.049 53.37×10?5[M＋H]+ 56.910.264 8148.052 55.17×10?5[M－H]? 613.030.375 8132.077 93.48×10?5[M－H]? 718.540.421 6465.309 03.28×10?5[M＋H]+ 820.230.136 8449.314 44.75×10?5[M＋H]+ 920.970.236 3299.282 44.17×10?5[M＋H]+ 1021.460.169 2467.301 33.86×10?5[M＋H]+

3.5.3 差異代謝物分析與鑒定 PLS-DA得分圖可看出，正常肝細胞和肝癌細胞明顯分離，表明肝癌細胞內(nèi)源性代謝與正常肝細胞內(nèi)源性代謝產(chǎn)生差異；藥物干預組與肝癌細胞組明顯分離（圖7-A）。為了驗證模型可靠性，對上述模型數(shù)據(jù)進行排列實驗（＝200），評判標準參考課題組已發(fā)表文獻報道[21]，相關驗證結果表明模型可靠（圖7-B）。

OPLS-DA得分圖顯示正常肝細胞組和肝癌組明顯分離（圖7-C），表明肝癌細胞代謝輪廓發(fā)生改變。借助HMDB數(shù)據(jù)庫及NCBI數(shù)據(jù)庫對正常肝細胞組、肝癌細胞組和藥物干預組的顯著性差異物進行鑒定指認，共鑒定指認出20個與肝癌相關的差異代謝物（表3）。

3.5.4 柴胡注射液對差異代謝物的影響 如圖8所示，與模型組比較，柴胡注射液能夠回調(diào)的差異代謝物有10種，如涉及脂質代謝的神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0），涉及糖酵解途徑的3-磷酸甘油酸，涉及脂肪酸代謝的肉桂酸、2-羥基己酸，涉及氨基酸代謝的-正亮氨酸、谷氨酰胺，涉及核苷酸代謝的胞嘧啶核苷、尿苷、鳥嘌呤均顯著下降（＜0.05、0.01、0.001），涉及核苷酸代謝的次黃嘌呤顯著上升（＜0.01）。

圖7 各組樣品PLS-DA得分圖(A) 及其模型驗證圖(B)、正常肝細胞和肝癌細胞樣本的OPLS-DA得分圖(C) 及S-Plot圖(D)

表3 各組樣本差異代謝物

Table3 Differential metabolites of samples in each group

編號tR/minm/z離子模式代謝物SMCC-7721細胞vs LO-2細胞柴胡注射液vs SMMC-7721細胞通路 11.50149.105 2[M＋H]+三乙醇胺↓↓脂質代謝 220.97299.282 4[M＋H]+鞘氨醇↓↓脂質代謝 330.61538.519 7[M＋H]+神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0）↑↓脂質代謝 421.46467.301 3[M＋H]+溶血卵磷脂（14∶0/0∶0）↓—脂質代謝 51.92185.992 4[M－H]?3-磷酸甘油酸↑↓糖酵解途徑 66.91148.052 5[M－H]?肉桂酸↑↓脂肪酸代謝 713.03132.077 9[M－H]?2-羥基己酸↑↓脂肪酸代謝 81.91203.115 9[M＋H]+乙酰肉堿↓—脂肪酸代謝 918.54465.309 0[M＋H]+甘氨膽酸↓↓膽汁酸代謝 1020.23449.314 4[M－H]?甘氨熊脫氧膽酸↓↓膽汁酸代謝 113.43131.094 8[M－H]?L-正亮氨酸↑↓氨基酸代謝 121.55147.052 9[M＋H]+谷氨酸↓↓氨基酸代謝 131.40146.069 2[M－H]?谷氨酰胺↑↓氨基酸代謝 142.10111.043 5[M＋H]+胞嘧啶↑↑核苷酸代謝 151.93243.085 6[M＋H]+胞嘧啶核苷↑—核苷酸代謝 163.16244.069 4[M＋H]+尿苷↑↓核苷酸代謝 172.73136.038 6[M＋H]+次黃嘌呤↓↑核苷酸代謝 183.10152.033 2[M－H]?黃嘌呤↓↓核苷酸代謝 195.74151.049 5[M＋H]+鳥嘌呤↑↓核苷酸代謝 202.00347.063 1[M＋H]+5′-磷酸腺苷↓↓核苷酸代謝

“↑”表示升高；“↓”表示降低；“—”表示無變化

“↑” indicates increasing; “↓” indicates decreasing; “—” indicates no change

與正常組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.5.5 差異代謝物的代謝通路分析 為更好分析各差異代謝物在正常肝細胞、肝癌細胞、藥物干預組間的內(nèi)在聯(lián)系，借助在線京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對上述差異代謝物做整合代謝通路分析（圖9）。10種柴胡注射液回調(diào)的差異代謝物主要涉及核苷酸代謝、脂肪酸代謝途徑、氨基酸代謝途徑等。

4 討論

肝癌即肝臟惡性腫瘤，外科通常以手術為主，由于其解剖部位特殊，治療效果不佳，存在一定風險，現(xiàn)多以中西醫(yī)結合治療為主[6]。柴胡具有疏肝解郁、保肝柔肝的功效，臨床上運用柴胡注射液配合TACE技術治療肝癌取得較好療效，但是柴胡注射液抑制肝癌細胞增殖以及誘導其凋亡的作用機制還需要探究。

代表肝癌細胞組與正常肝細胞組比較的變化；代表給藥組與肝癌細胞組比較的變化

研究發(fā)現(xiàn)，節(jié)律基因的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，且已在肝癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中得到證實[22]?；蚴遣溉閯游镏凶畲蟮纳镧娀?，在肝癌細胞中高表達，促進細胞周期G1/S期的轉化，從而提高肝癌細胞的生存率[23]。研究報道CDC25A蛋白通過調(diào)控下游CDK2-cyclin A復合物參與S-G2的進程，CDC25A的轉錄表達受到基因的調(diào)控[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡注射液可以顯著抑制肝癌細胞增殖，使肝癌細胞阻滯于S期與G2期，為了探究其作用機制，借助qRT-PCR及Western blotting技術對相關基因與蛋白進行測定，結果表明細胞阻滯于S期可能是由于柴胡注射液下調(diào)NPAS2，進而下調(diào)CDC25A，導致CDK2-cyclin A復合物表達水平下調(diào)，進而導致肝癌細胞S期過渡到G2期受阻。CDC25B在多種腫瘤中高表達，能夠阻滯細胞周期[26]。研究發(fā)現(xiàn)CDC25B作為G2/M期過渡的關鍵基因，通過調(diào)控下游底物CDK1-cyclin B1復合物去磷酸化參與G2/M進程[27]。qRT-PCR結果提示肝癌細胞在G2期受阻可能是因為柴胡注射液下調(diào)基因從而導致CDK1-cyclin B1復合物表達下降，G2/M肝癌周期進程受阻。為了探究肝癌細胞凋亡機制，采用Western blotting技術檢測凋亡蛋白表達，結果提示柴胡注射液通過調(diào)控Bax/Bcl-2值，促使Cyt-C從線粒體釋放，進而激活下游Caspase-3蛋白，從而引起肝癌細胞凋亡。但也有研究發(fā)現(xiàn)CDC25A蛋白可以調(diào)控Bcl-2蛋白去磷酸化參與肝癌細胞凋亡[24]，因此推測柴胡注射液可能會通過下調(diào)NPAS2，進而下調(diào)CDC25A的表達，下調(diào)Bcl-2蛋白去磷酸化，從而促進肝癌細胞凋亡。

與正常細胞相比，腫瘤細胞因其基因或者表觀遺傳的改變，導致許多代謝通路發(fā)生紊亂[28]。為了探究柴胡注射液是通過何種代謝通路導致肝癌細胞發(fā)生阻滯與凋亡，采用代謝組學方法鑒定了20個與肝癌相關的差異代謝物；其中柴胡注射液能夠回調(diào)的肝癌細胞差異代謝物有10種。研究報道神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0）通過調(diào)控參與內(nèi)質網(wǎng)應激的轉錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）/C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）復合物發(fā)揮抗細胞凋亡作用[29]。本研究結果發(fā)現(xiàn)柴胡注射液可能通過調(diào)控神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0）合成，進而激活內(nèi)質網(wǎng)應激，從而發(fā)揮促進肝癌凋亡。病理情況下，細胞更傾向于糖酵解途徑供能[30]，3-磷酸甘油酸的生成是糖酵解途徑中的重要環(huán)節(jié)，柴胡注射液組3-磷酸甘油酸顯著下降，提示柴胡注射液可能通過阻滯糖酵解途徑，干預3-磷酸甘油酸的生成，進而阻斷肝癌細胞的能量供應。研究發(fā)現(xiàn)干擾脂肪酸的合成可以抑制腫瘤細胞的增殖[31]；乙酰輔酶A是合成脂肪酸的原料，肉桂酸參與乙酰輔酶A的合成[32]，2-羥基己酸參與脂肪酸代謝途徑[33]，結果發(fā)現(xiàn)柴胡注射液組肉桂酸及2-羥基己酸顯著下調(diào)，因此推測柴胡注射液通過調(diào)控脂肪酸代謝途徑，從而抑制肝癌細胞的增殖。腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開氨基酸代謝的參與[34]，臨床實驗發(fā)現(xiàn)肝癌患者血漿中多種氨基酸水平發(fā)生明顯改變[35]，本研究結果表明柴胡注射液通過干預-正亮氨酸、谷氨酰胺的合成從而導致肝癌細胞的凋亡。相關肝癌研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者體內(nèi)存在核苷酸代謝異常[36]，因此柴胡注射液組鳥嘌呤顯著降低，可能與次黃嘌呤的增加相關；可能是由于柴胡注射液阻斷了次黃嘌呤向鳥嘌呤的轉化；另外柴胡注射液組胞嘧啶顯著增加，而尿苷顯著降低，表明柴胡注射液可能阻滯胞嘧啶向尿苷的轉化，進而可能阻斷肝癌中DNA的合成從而導致肝癌細胞凋亡。

綜上，柴胡注射液不僅能夠抑制肝癌細胞的增殖而且能夠使其凋亡，肝癌細胞阻滯于S期主要與NPAS2-CDC25A-CDK2-cyclin A通路有關，阻滯于G2期主要與CDC25B、CDK1-cyclin B1復合物有關，凋亡主要與NPAS2-CDC25A、Bax/Bcl-2、Caspase-3有關，代謝組學結果提示還與核苷酸、脂質與氨基酸代謝等通路密切相關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 293.

[2] 姜曉倩, 王麗寧. 柴胡疏肝化瘀方聯(lián)合侖伐替尼治療(氣滯血阻證) 原發(fā)性肝癌的臨床療效 [J]. 中西醫(yī)結合肝病雜志, 2022, 32(5): 462-464.

[3] 許嚴偉, 耿勝男, 王夢琪, 等. 柴胡皂苷D對阿霉素治療小鼠肝癌的靶向導引作用[J]. 中草藥, 2021, 52(3): 778-788.

[4] 鄧晶晶, 唐嘉曦, 李婷婷, 等. 柴胡注射液有效成分的含量測定及指紋圖譜模式識別的研究 [J]. 華西藥學雜志, 2018, 33(1): 76-79.

[5] 張國順, 李盛楠, 孟冬梅, 等. 肝動脈化療栓塞術聯(lián)合射頻消融術治療原發(fā)性肝癌 [J]. 中國老年學雜志, 2019, 39(8): 1855-1857.

[6] 劉芝雁, 段秀萍, 辛偉, 等. 柴胡注射液結合TACE技術治療肝癌效果觀察 [J]. 中醫(yī)臨床研究, 2017, 9(26): 11-12.

[7] 吳薏婷. 痰熱清注射液治療肝癌TACE術后發(fā)熱60例 [J]. 福建中醫(yī)藥, 2005, 36(2): 23-24.

[8] 劉曉斌, 張正祥, 吉金山, 等. 柴胡注射液對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖及凋亡的影響 [J]. 陜西醫(yī)學雜志, 2016, 45(3): 279-281.

[9] 唐婷婷. 柴胡注射液對人肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的影響 [D]. 武漢: 湖北中醫(yī)學院, 2008.

[10] 董菲, 孫成銘. 節(jié)律基因在腫瘤中的研究進展 [J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2016, 37(7): 941-944.

[11] 張霞, 李杰. 生物鐘在腫瘤中的研究進展 [J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2012, 33(24): 3030-3031.

[12] 楊柳青, 石漢平. 晝夜節(jié)律與腫瘤 [J]. 腫瘤代謝與營養(yǎng)電子雜志, 2017, 4(3): 338-342.

[13] 王愛武, 鐘碧玲, 周揚帆, 等. 乳腺浸潤性導管癌中生物鐘基因NPAS2的表達及臨床病理分析 [J]. 廣東醫(yī)學, 2021, 42(7): 751-755.

[14] 李波, 劉峰舟, 劉明莉, 等.基因敲除的HepG2細胞系構建及其對肝癌細胞凋亡的影響 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2017, 17(29): 5618-5622.

[15] Loyer P, Trembley J H, Katona R,. Role of CDK/cyclin complexes in transcription and RNA splicing [J]., 2005, 17(9): 1033-1051.

[16] 賈海全. RNAi Cyclin E對肝癌HepG2細胞生長及細胞周期的影響[D]. 鄭州: 鄭州大學, 2012.

[17] 李雨萌, 陳瑩. 代謝組學在惡性腫瘤診斷中的應用研究進展 [J]. 醫(yī)學研究與教育, 2016, 33(3): 42-46.

[18] 金艷書, 吳學敏, 婁金麗. 苦參堿對人肝癌細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡的影響 [J]. 中國臨床康復, 2006, 10(3): 107-109.

[19] 司維柯, 羅朝學, 陳慶海. 流式細胞術分析苦參堿誘導人肝癌細胞HepG2凋亡 [J]. 腫瘤, 2001, 21(3): 213-214.

[20] 王珂欣, 高麗, 周玉枝, 等. 苦參堿抗肝癌細胞增殖的1H-NMR代謝組學研究 [J]. 中草藥, 2017, 48(20): 4275-4283.

[21] 梁梅麗, 趙芳, 方媛, 等. 基于LC-MS技術的柴胡石油醚部位對抑郁癥模型大鼠海馬組織的代謝組學研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(10): 2291-2301.

[22] 陳雅凡, 王剛, 田藝苑, 等. 節(jié)律基因NPAS2在腫瘤中的研究進展 [J]. 中國癌癥防治雜志, 2022, 14(5): 569-574.

[23] 郭靜. 周期節(jié)律蛋白NPAS2抑制乳腺癌細胞增殖的機制研究 [D]. 大連: 大連理工大學, 2018.

[24] Yuan P, Li J B, Zhou F,. NPAS2 promotes cell survival of hepatocellular carcinoma by transactivating CDC25A [J]., 2017, 8(3): e2704.

[25] Tu Y S, Kang X L, Zhou J G,. Involvement of Chk1-Cdc25A-cyclin A/CDK2 pathway in simvastatin induced S-phase cell cycle arrest and apoptosis in multiple myeloma cells [J]., 2011, 670(2/3): 356-364.

[26] 王志, 周晶晶, 張靜. 細胞分裂周期因子CDC25B在腫瘤中作用的研究進展 [J]. 延安大學學報: 醫(yī)學科學版, 2022, 20(1): 85-88.

[27] Lammer C, Wagerer S, Saffrich R,. The cdc25B phosphatase is essential for the G2/M phase transition in human cells [J]., 1998, 111(16): 2445-2453.

[28] 郭文正, 鄧炯. 腫瘤代謝研究新進展 [J]. 國際腫瘤學雜志, 2015, 42(4): 277-280.

[29] Senkal C E, Ponnusamy S, Bielawski J,. Antiapoptotic roles of ceramide-synthase-6-generated C16-ceramide via selective regulation of the ATF6/CHOP arm of ER-stress-response pathways [J]., 2010, 24(1): 296-308.

[30] Xu S L, Herschman H R. A tumor agnostic therapeutic strategy for hexokinase 1-null/hexokinase 2-positive cancers [J]., 2019, 79(23): 5907-5914.

[31] 劉暢, 張一帆. 脂肪酸代謝在惡性腫瘤發(fā)生機制及分子影像中的應用 [J]. 分子影像學雜志, 2020, 43(1): 16-19.

[32] Zhao K J, Chen Y, Hong S J,. Characteristics of β-oxidative and reductive metabolism on the acyl side chain of cinnamic acid and its analogues in rats [J]., 2019, 40(8): 1106-1118.

[33] 趙超群. 基于代謝組學技術的慢性乙型肝炎及非酒精性脂肪性肝病“濕熱證”的物質基礎研究 [D]. 上海: 上海中醫(yī)藥大學, 2020.

[34] 高紅梅, 楊仕儀. 腫瘤氨基酸代謝研究進展 [J]. 解放軍醫(yī)藥雜志, 2021, 33(8): 112-116.

[35] Shariff M I, Gomaa A I, Cox I J,. Urinary metabolic biomarkers of hepatocellular carcinoma in an Egyptian population: A validation study [J]., 2011, 10(4): 1828-1836.

[36] 李君, 孫淑軍, 王洋, 等. 29例肝細胞肝癌患者的腫瘤組織代謝組學研究 [J]. 世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2017, 19(4): 578-586.

Mechanism of Bupleurum Injection against liver cancer based on molecular biology and metabolomics

CHEN Yi-xiao1, 2, 3, WANG Wei-yu1, 2, 3, FENG Jian-you1, 2, 3, QIN Xue-mei1, 2, 3, GAO Xiao-xia1, 2, 3

1. Modern Research Center of Traditional Chinese Medicine at Shanxi University, Taiyuan 030006, China 2. Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 3. Shanxi Provincial Key Laboratory of Research and Utilization of Functional Substances in Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030006, China

To explore the effect and mechanism of Bupleurum Injection (柴胡注射液, BI) on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.Human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells and normal human hepatocytes (LO-2) were cultured, and different concentrations of BI were given for intervention. MTT assay and scratch test were used to detect cell proliferation and migration. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. qRT-PCR and Western blotting were used to detect the expressions of genes and proteins related to cycle arrest, apoptosis and migration. Metabolomics technology was used to detect the changes of endogenous differences in hepatocellular carcinoma cells before and after BI intervention, and the metabolic pathway regulated by BI was analyzed by Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG).BI (100—450 mg/mL) significantly inhibited the proliferation of hepatocellular carcinoma cells (< 0.01, 0.001), arrested the cells in S phase and G2phase (< 0.05), promoted the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells (< 0.001), and inhibited the migration of hepatocellular carcinoma cells (< 0.05, 0.001), which indicated that BI had significant anti-hepatoma effect. BI significantly decreased neuronal pas domain protein 2 (), cell division cycle 25A (), cyclin-dependent kinase 2 (),,,andmRNA expression (< 0.01, 0.001), down-regulated NPAS2, CDC25A and B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) protein expressions (< 0.001), up-regulated Bcl-2 associated X protein (Bax), cytochrome-C (Cyt-C), cystein-asparate protease-3 (Caspase-3), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) protein expressions (< 0.01, 0.001). The results of metabolomics showed that BI interfered with nucleotide metabolism, lipid metabolism, glycolytic pathway, amino acid metabolism and fatty acid metabolism.BI can block and promote apoptosis of SMMC-7721 cells. The possible mechanism is that down-regulation of NPAS2-CDC25A can block cells in S phase, down-regulation of CDC25B, CDK1 and cyclin B1 can block cells in G2phase, down-regulation of MMP-9/TIMP-1 can inhibit the migration of hepatocellular carcinoma cells, and regulate the metabolism of nucleotides, lipids and amino acids, thus inducing apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

Bupleurum Injection; liver cancer; apoptosis; cell cycle; migration; metabolomics

R285.5

A

0253 - 2670(2023)17 - 5590 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.013

2023-04-04

國家自然科學基金面上項目（82174099）；山西省基礎應用項目面上項目（20210302123432）；名優(yōu)晉藥再開發(fā)山西省重點實驗室（202104010910001）；地產(chǎn)中藥功效物質研究與利用山西省重點實驗室（201605D111004）

陳一笑（1997—），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥動學。Tel: 15383417482 E-mail: yixiaochen2021@163.com

高曉霞，女，博士生導師，教授，從事中藥藥動學、中醫(yī)藥代謝組學等研究。Tel: (0351)7019297 E-mail: gaoxiaoxia@sxu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]