蔣 勇，鐘淑欣，何升華，梁家彬，張浩宇，葉裕豐，陳漢威

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究防風中生物活性成分及對類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制

蔣 勇1, 2，鐘淑欣3，何升華4，梁家彬1, 2，張浩宇1, 2，葉裕豐2*，陳漢威2, 5*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 510006 2. 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院 中心實驗室，廣東 廣州 511486 3. 暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033 5. 廣州市番禺區(qū)健康管理中心，廣東 廣州 511495

通過以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)的策略研究防風治療類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的分子生物學(xué)機制。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法收集防風活性成分和治療RA的潛在靶點，并評估活性成分的藥理和毒理學(xué)等相關(guān)參數(shù)；構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點，并通過生物信息學(xué)方法進一步驗證核心靶點和疾病的關(guān)聯(lián)；對核心成分和相應(yīng)靶點進行分子對接。體外通過CCK-8實驗、細胞遷移和侵襲、細胞凋亡、qRT-PCR和Western blotting分析，闡明別歐前胡素對MH7A細胞磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路的調(diào)控作用。從防風中共鑒定出18種活性成分和66個與篩選出的RA疾病靶基因相交的潛在靶基因，最終獲得了漢黃芩素、β-谷甾醇、5--甲基維斯阿米醇和別歐前胡素等核心成分。防風治療RA的潛在機制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、凋亡等信號通路和多種生物過程來實現(xiàn)，以發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。分子對接證實了所有的核心成分和關(guān)鍵靶點均具有很好的對接活性。別歐前胡素抑制MH7A細胞的活力、遷移和侵襲（＜0.05、0.01），誘導(dǎo)細胞凋亡（＜0.01），并顯著下調(diào)、、、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，）和的基因表達（＜0.01）。分子分析表明別歐前胡素通過抑制PI3K/Akt通路發(fā)揮對MH7A的調(diào)控作用。成功預(yù)測了防風治療RA的有效成分和潛在靶點，為進一步探究其分子機制提供了新的理論基礎(chǔ)。揭示了別歐前胡素通過PI3K/Akt通路抑制RA成纖維樣滑膜細胞的活力、遷移、侵襲及細胞因子和MMPs的表達，并誘導(dǎo)細胞凋亡。

防風；類風濕關(guān)節(jié)炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；發(fā)病機制；別歐前胡素；漢黃芩素；5--甲基維斯阿米醇；成纖維樣滑膜細胞；PI3K/Akt信號通路

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的慢性全身性自身免疫疾病，主要損害關(guān)節(jié)，以對稱性滑膜炎癥為特征。目前，RA的全球發(fā)病率為0.5%～1.0%，以女性為多見，其晚期形式的特點為嚴重且使人衰弱的慢性疼痛，管理不善會進一步導(dǎo)致疾病進展，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕、破壞和畸形[1]。迄今尚無有效的針對RA的治療方法，目前的西醫(yī)治療主要用于減少關(guān)節(jié)炎癥、防止不可逆的骨破壞和盡可能維持關(guān)節(jié)功能，但構(gòu)成高昂的財務(wù)成本并表現(xiàn)出嚴重的不良反應(yīng)[2]。滑膜炎是RA的病理基礎(chǔ)，而成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs）是RA中具有免疫作用的核心靶細胞。在RA滑膜炎性環(huán)境中，F(xiàn)LSs發(fā)生凋亡異常，導(dǎo)致RA滑膜增生，聚積并黏附在骨和軟骨上加重關(guān)節(jié)破壞[3]。同樣，RA-FLSs“類腫瘤樣”異常增殖，會導(dǎo)致細胞過度活化，遷移、侵襲能力加強，產(chǎn)生大量的蛋白酶、細胞因子和黏附分子促使軟骨破壞，進一步激活破骨細胞造成骨破壞，并且激活的FLSs還可以通過與鄰近血管內(nèi)皮細胞發(fā)生串擾來調(diào)節(jié)炎癥浸潤的侵入，在關(guān)節(jié)骨和軟骨的破壞中也發(fā)揮重要作用[4-8]。

防風(Turcz.) Schisch廣泛分布于東西伯利亞和北亞[9]。首載于秦漢時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，一般規(guī)定用防風祛風解表、祛濕止痛、定驚，與現(xiàn)代應(yīng)用大致相符，對普通感冒、頭痛、風疹、瘙癢、破傷風、風濕病和關(guān)節(jié)痛有明顯的治療作用[10-11]。防風在當前臨床實踐中被廣泛用于治療炎癥、疼痛和關(guān)節(jié)炎等[12]。防風含有100多種化學(xué)成分，主要有色原酮類、香豆素類、多糖類、聚乙炔等，這些活性成分有解熱、抗炎鎮(zhèn)痛、抗增殖、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[13-15]?；谙到y(tǒng)生物學(xué)與藥理學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，是評價藥物的代謝和有效性特征，分析藥物治療疾病的具體途徑，揭示藥物作用的分子機制的強有力方法[16-17]。分子對接技術(shù)可以評估分析藥物與疾病關(guān)鍵靶點結(jié)合的活性和機制，對進一步藥物篩選和研發(fā)提供一些見解[18]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、微陣列數(shù)據(jù)分析和分子對接技術(shù)系統(tǒng)地鑒定防風活性成分的有效靶蛋白，探索防風治療RA的分子機制，篩選出防風治療RA的活性成分和重要信號通路，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 細胞

人RA成纖維樣滑膜細胞系MH7A購自吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

別歐前胡素（批號D21091501，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批號031825）購自美國Peprotech公司；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑LY294002（批號134167）購自美國MCE公司；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX，批號02211101）購自山西普德藥業(yè)有限公司；Matrigel膠（批號2082001）購自美國Corning公司；胎牛血清（批號SA220629）、胰蛋白酶溶液（批號WH0622G111）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號8123020）、青霉素-鏈霉素（批號2321131）購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號VB816）購自日本DOJINDO公司；總RNA提取試劑盒（批號343904）購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號H0104731）購自上海翊圣生物科技有限公司；SYBR Green qPCR試劑盒（批號027E2232EB）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（批號20220610）、全蛋白提取試劑盒（批號20221009）、BCA測定試劑盒（批號20220427）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測溶液（批號2127701）購自美國Millipore公司；特大B細胞淋巴瘤（B-cell lymphoma-extra-large，Bcl-xL）抗體（批號F1741）購自英國EterLife公司；B淋巴細胞瘤-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）抗體（批號GR151406-19）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號GR46472-1）購自英國Abcam公司；PI3K抗體（批號CJ36131）、p-PI3K抗體（批號AA10171）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號CN13211）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）p-Akt抗體（批號AA44161）、抗體（批號1201908）、HRP標記山羊抗兔二抗（批號AA102109）購自美國Bioworld公司。

1.3 儀器

5804R型冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）；371型CO2培養(yǎng)箱、1300 series A2型生物安全柜、Variskan LUX microplate reader多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DMI1型倒置光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）；LightCycler480 II Real-time PCR系統(tǒng)（瑞士Roche公司）；CytoFLEX Flow Cytometer流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；PowerPac HC型垂直電泳/轉(zhuǎn)膜套裝、Bio-Rad Gel-Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 防風中的有效成分和靶點 在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、YaTCM（http://cadd. pharmacy.nankai.edu.cn/yatcm）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）和TCMIP（http://www.tcmip.cn/TCMIP）4個中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索和收集防風的化學(xué)成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為主要的藥動學(xué)參數(shù)（符合這一標準的化合物具有更高的類藥物特性）對防風的成分進行篩選[19]，同時通過文獻檢索進行補充，獲得最終候選目標活性成分。然后，搜集TCMSP中預(yù)測的與這些活性分子相對應(yīng)的靶點。所有活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)均來自PubChem數(shù)據(jù)庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）。

2.1.2 藥理和毒理參數(shù)評估 通過參考里賓斯基“五規(guī)則”（rule of 5，RO5），評估活性成分的“類藥物”特性，符合該規(guī)則的化合物有更好的藥動學(xué)性質(zhì)和更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物。化合物毒性的預(yù)測是藥物設(shè)計開發(fā)過程的關(guān)鍵部分之一。ProTox-II網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（https://tox-new.charite.de/protox_II）用于預(yù)測獲得的活性成分的毒理學(xué)參數(shù)，包括毒理學(xué)終點（免疫毒性、致突變性和致癌性）、器官毒性（肝毒性）和急性口服毒性（median lethal dose，LD50）。活性成分的合成可及性得分（synthetic accessibility score，SAscore）通過ADMETlab 2.0（https://admetmesh.scbdd.com）計算，SAscore旨在計算類藥物分子的合成難度，SAscore＜6表示容易合成，否則難以合成。

2.1.3 防風-RA潛在靶基因 為確保數(shù)據(jù)的全面性與準確性，從GeneCard（https://www.genecards.org）、OMIM（https://omim.org/search/advanced/geneMap）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/search）、DRUGBANK（https://go.drugbank.com）4個數(shù)據(jù)庫中收集RA相關(guān)的靶點。其中DRUGBANK數(shù)據(jù)庫基于臨床試驗藥物證據(jù)構(gòu)建而成，包含豐富的藥物數(shù)據(jù)與全面的藥物靶標信息，GeneCard、OMIM、DisGeNET 3個數(shù)據(jù)庫基于現(xiàn)有文獻構(gòu)建，各個數(shù)據(jù)庫之間優(yōu)勢互補。將上述4個數(shù)據(jù)庫獲取的靶基因，刪除重復(fù)項后合并。使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https:// www.uniprot.org）將藥物成分和疾病的目標統(tǒng)一規(guī)范為標準“Gene Symbol”，通過VENNY 2.1網(wǎng)站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲取防風治療RA的潛在靶基因（即共存靶基因）。

通過收集基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)集（GSE93272和GSE97779）的對照組和RA組中差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），分析與RA發(fā)病機制相關(guān)的防風靶標的標準化表達水平。此外，通過Panther分類系統(tǒng)（http://pantherdb.org）進行潛在靶基因的功能分類。

2.1.4 防風-RA潛在靶基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 通過將獲取的防風-RA潛在靶基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）并選擇生物體為“Homo sapiens”，設(shè)置靶基因交互得分的置信度為0.40，以獲得PPI網(wǎng)絡(luò)來呈現(xiàn)潛在靶基因之間互作的直接與間接調(diào)控關(guān)系。PPI網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點代表1個蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)，即潛在靶基因相互之間共同功能的關(guān)聯(lián)。將這些結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1對目標蛋白進行包含拓撲參數(shù)的可視化PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將防風-RA共同靶基因?qū)隦（https://www.r-project.org）軟件，利用“Cluster Profiler”包進行生物信息富集分析，包括GO功能和KEGG信號通路分析。＜0.05為顯著富集，結(jié)果用R軟件繪制氣泡圖和條形圖來直觀地顯示。R包“pathview”和“GOplot”分別用于將KEGG數(shù)據(jù)映射到RA相關(guān)的信號通路圖上并顯示出來和繪制Chord plot將靶基因映射到GO或KEGG條目來反應(yīng)歸屬關(guān)系。

2.1.6 靶點-器官定位網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 防風體內(nèi)代謝過程尚未明確，防風誘導(dǎo)的RA治療作用可能涉及多個器官和組織。通過使用BioGPS數(shù)據(jù)庫（http:// biogps.org）獲得每個防風-RA靶點在器官組織水平的mRNA表達譜。分別計算每個mRNA在每個組織或器官中的平均值和在所有組織器官中的總體平均值，提取mRNA表達值高于總體值的相關(guān)組織器官。使用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建靶點-器官定位網(wǎng)絡(luò)。

2.1.7 “成分-潛在靶基因-信號通路（ingredients-potential target genes-signaling pathways，IPS）”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建IPS網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點代表活性化合物、靶基因或信號通路，線條則代表活性化合物、靶基因和信號通路三者之間的相互作用。利用Cytoscape 3.7.1中內(nèi)置的“Network Analyzer”功能分析活性成分和靶基因的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括連接度、介度、緊密度等，并據(jù)此鑒定核心靶基因和化合物。

2.1.8 核心成分和核心靶點的分子對接驗證 對IPS核心網(wǎng)絡(luò)（Hithubs Network）中得到的核心成分和靶基因按照化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中的組合關(guān)系進行分子對接驗證。首先從PubChem數(shù)據(jù)庫下載活性成分的SDF格式文件并利用Chem 3D軟件進行能量最小化計算后轉(zhuǎn)換為MOL2格式文件。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）下載分辨率低于0.2 nm（優(yōu)先選擇分辨率值更小且有小分子復(fù)合的結(jié)構(gòu)）的靶蛋白的PDB結(jié)構(gòu)文件，并使用AutoDock Tools1.5.7軟件進行去雜原子、氫化、計算電荷等加工。運行AutoDock Vina 1.2.3進行分子對接，以對接評分Affinity＜?20.929 3 kJ/mol表明具有較強的結(jié)合活性[20]。最后，通過CB-Dock網(wǎng)站（http://clab. labshare.cn/cb-dock）將結(jié)果進行可視化。

2.2 細胞實驗

2.2.1 細胞培養(yǎng)和處理 MH7A細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48～72小時傳代1次（細胞融合度達到80%～90%時用胰蛋白酶溶液消化細胞）。MH7A細胞以1×105/mL接種于相應(yīng)培養(yǎng)皿中，給予TNF-α（10 ng/mL），別歐前胡素（20、40、60 μmol/L），MTX（20 μmol/L）或LY294002（20 μmol/L）干預(yù)24 h或48 h。

2.2.2 細胞活力測定 MH7A細胞分別給予別歐前胡素（20、40、60、80、120、160 μmol/L）處理24、48 h，然后用CCK-8試劑孵育3 h，酶標儀在450 nm處檢測吸光度（）值，計算細胞活力。

2.2.3 劃痕愈合測定 細胞融合度達到80%時更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，用藥物預(yù)處理24 h，再使用移液管尖端制造傷口，記作0 h，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。分別在0、24、48 h進行拍照，計算遷移細胞數(shù)。

2.2.4 遷移和侵襲測定 細胞用藥物預(yù)處理12 h后轉(zhuǎn)移至Transwell小室，24 h（遷移）或48 h后（侵襲，Matrigel膠包被）對小室進行固定、染色、拍照并計數(shù)。

2.2.5 qRT-PCR檢測、、、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，）和基因表達 按照試劑盒說明書提取細胞中總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因引物序列 (5’-3’) IL-1βF: CAGGCTGCTCTGGGATTCTC R: GTCCTGGAAGGAGCACTTCAT IL-6F: CCTGAACCTTCCAAAGATGGC R: TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA IL-8F: GAAGTTTTTGAAGAGGGCTGAGA R: GCCCTTGGCCTCAATTTTGC MMP-1F: ATGAAGCAGCCCAGATGTGGAG R: TGGTCCACATCTGCTCTTGGCA MMP-3F: TGGACAAAGGATACAACAGGGAC R: ATCTTGAGACAGGCGGAACC GAPDHF: TCGGAGTCAACGGATTTGGT R: TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC

2.2.6 細胞凋亡測定 收集藥物干預(yù)48 h后的細胞，PBS洗滌3次，在細胞緩沖液中依次加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）孵育5～10 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.2.7 Western blotting檢測PI3K/Akt通路和凋亡相關(guān)蛋白表達 使用全蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，并用BCA測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入p-Akt（1∶750）、Akt（1∶750）、p-PI3K（1∶750）、PI3K（1∶750）、Bax（1∶5000）、cleaved Caspase-3（1∶500）、Bcl-xL（1∶1000）和GAPDH（1∶5000）抗體，4 ℃孵育過夜。然后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光檢測溶液后，使用Bio-Rad Gel-Doc XR+可視化蛋白條帶。使用Image Lab軟件對條帶進行量化。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 防風活性成分的藥理學(xué)性質(zhì)和靶基因 以O(shè)B≥30%、DL≥0.18標準對防風檢索出的成分進行篩選并結(jié)合文獻檢索，最終獲得19種活性成分。其中升麻素苷（Hacc＞10），其余18種活性成分符合“RO5”（MW＜500、Hdon＜5、Hacc＜10、?2＜log＜5、RBN＜10）。這些活性成分的相關(guān)藥理參數(shù)見表2。通過檢索HERB數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）分析它們在中藥中分布情況。結(jié)果表明，它們在防風中具有高度特異性。11-羥基-亥茅酚苷_qt、divaricatacid和珊瑚菜內(nèi)酯僅存在于防風中，防風色酮醇和divaricatol存在于包括防風在內(nèi)的2種中藥中，川白芷內(nèi)酯和別歐前胡素則是3種。防風的所有活性成分均未表現(xiàn)出肝毒性，亞油酸乙酯和11,14-二十碳二烯酸甲酯的LD50值最高（圖1）。SAscore評估表明所有成分都是容易合成的。上述結(jié)果表明，篩選出的這些防風活性成分具有很高的“類藥物”藥理學(xué)性質(zhì)。在TCMSP收集到防風18種活性成分的218個靶蛋白，經(jīng)去重和驗證后得到80個靶蛋白。

表2 防風生物活性成分的藥理學(xué)和分子性質(zhì)

Table2 Pharmacological and molecular properties of bioactive components in S. divaricata

活性成分MWAlogPHdonHaccOB/%DLCaco-2BBBTPSARBNSAscore 黃花菜木脂素A386.382.492868.830.660.21?0.53107.5943.448 11-羥基-亥茅酚苷_qt292.310.883650.240.27?0.27?1.23100.1313.502 川白芷內(nèi)酯426.465.050759.650.660.56?0.0292.0463.932 divaricatacid320.321.342787.000.32?0.18?1.05106.2033.436 divaricatol334.351.252731.650.38?0.13?1.09106.2033.505 歐前胡素270.303.650434.550.221.130.9252.5832.782 防風色酮醇374.422.802732.050.510.07?0.81106.2043.718 珊瑚菜內(nèi)酯300.333.640543.390.280.900.4361.8142.815 5-O-甲基維斯阿米醇290.342.021537.990.250.54?0.1068.9023.466 珊瑚菜素300.333.640540.190.280.980.4861.8142.815 3-表-β-谷甾醇414.798.081136.910.751.320.8720.2364.388 漢黃芩素284.282.592530.680.230.790.0479.9022.288 β-谷甾醇414.798.081136.910.751.320.9920.2364.388 亞油酸乙酯308.566.990242.000.191.461.1426.30162.305 異歐前胡素270.303.650445.460.230.970.6652.5832.674 別歐前胡素270.303.791436.310.220.910.5063.5822.982 11,14-二十碳二烯酸甲酯322.597.550239.670.231.471.1026.30172.322 紫花前胡素328.393.960539.270.380.770.2565.7433.359

MW-相對分子質(zhì)量 Alog-辛醇/水分配系數(shù)的對數(shù) Hdon-氫鍵供體 Hacc-氫鍵受體 Caco-2-腸上皮通透性 BBB-血腦屏障 TPSA-拓撲極性表面積 RBN-化合物中可旋轉(zhuǎn)鍵的個數(shù)

MW-molecular weight Alog-log of octanol/water partition coefficient Hdon-hydrogen bond donors Hacc-hydrogen bond acceptors Caco-2-intestinal epithelial permeability BBB-blood-brain barrier TPSA-topological polar surface area RBN-rotation bonds number

圖1 防風生物活性成分的毒理學(xué)參數(shù)

3.1.2 防風治療RA的潛在靶基因及PPI網(wǎng)絡(luò)分析 選取GeneCard、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中評分大于中位數(shù)的靶點，合并DRUGBANK、OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點，去重得到5769個RA相關(guān)靶基因。利用VENNY 2.1工具將防風活性成分靶基因和RA靶基因取交集，得到66個潛在靶基因（圖2-A）。將該66個共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)來呈現(xiàn)靶點間相互作用的調(diào)控關(guān)系（圖2-B）。將這些結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建了66個節(jié)點、547條邊的可視化PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2-C），平均節(jié)點連接度為16.6。排名前12的關(guān)鍵靶點見圖2-D，18種活性成分靶向RA發(fā)病機制相關(guān)靶點的數(shù)量見圖2-E。

3.1.3 與RA發(fā)病機制相關(guān)的防風靶點的功能分類 FLSs功能障礙（如異常增殖、凋亡）導(dǎo)致滑膜增生，與免疫系統(tǒng)細胞相互作用從而產(chǎn)生一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)，而持續(xù)的滑膜炎癥是RA進展的主要原因[2]。通過Panther分類系統(tǒng)，對66個防風-RA靶點進行蛋白質(zhì)功能分類。與RA發(fā)病機制相關(guān)的66個防風靶點根據(jù)其細胞功能分為10個不同的類別，其中蛋白質(zhì)修飾酶、跨膜信號受體和基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是最豐富的類別（圖3-A）。涉及蛋白質(zhì)修飾酶的15個潛在防風靶點形成了1個具有13個節(jié)點和35個邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3-B），其中AKT1和CASP3是關(guān)鍵靶點。由酶活性介導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾在調(diào)節(jié)細胞活性和功能方面起著至關(guān)重要的作用，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞間相互作用、細胞增殖和凋亡等[21]。在蛋白質(zhì)修飾酶中（圖3-C），絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶與磷酸酶共同參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡過程關(guān)鍵元件的磷酸化狀態(tài)。CASP3、CASP8、CASP9則屬于Caspase家族蛋白酶，其在細胞程序性死亡中起關(guān)鍵作用。根據(jù)相關(guān)靶點的數(shù)量提出了可能的RA發(fā)病機制相關(guān)的蛋白質(zhì)修飾酶調(diào)節(jié)因子（圖3-D）。這些發(fā)現(xiàn)表明防風活性成分對RA的治療靶點與多個關(guān)鍵生物學(xué)功能密切相關(guān)。

A-Venn圖 B、C-PPI網(wǎng)絡(luò) D-排名前12的關(guān)鍵靶點 E-防風中18種活性成分靶向RA發(fā)病機制相關(guān)靶點的數(shù)量

3.1.4 防風生物活性成分治療RA的潛在協(xié)同機制 GO分析結(jié)果顯示66個靶基因在1081個GO生物過程（biological process，BP）條目中顯著富集，基于調(diào)整后值排序的前20個富集項繪制的條形-氣泡圖如圖4-A所示。主要豐富的BP條目是對激素的反應(yīng)、細胞死亡的正向調(diào)節(jié)等。前8個BP條目的數(shù)據(jù)導(dǎo)入R包“GOplot”繪制“GOChord plot”來直觀地映射“條目”與“基因”的歸屬關(guān)系（圖4-B）。RA在女性中患病率較高，大量的研究表明激素與RA的發(fā)病和臨床表現(xiàn)密切相關(guān)[22]。27個RA相關(guān)的防風目標密切參與對激素的反應(yīng)并形成1個包含25個節(jié)點和173個邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4-C）。其中有9個是關(guān)鍵靶點，在這個PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用（即圖4-C內(nèi)一圈）。FLSs凋亡異常導(dǎo)致的持續(xù)滑膜炎癥在RA的發(fā)病機制中具有重要的意義。19個防風目標參與細胞死亡的正向調(diào)節(jié)，并形成1個具有18個節(jié)點和112個邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4-D）。表明防風的有效成分通過多種BP起到治療RA的協(xié)同作用。

同樣，KEGG富集分析結(jié)果顯示66個靶基因在215個信號通路中顯著富集?；谡{(diào)整后值排序的前20個KEGG富集項如圖4-E所示。KEGG通路主要涉及對PI3K/Akt、IL-17和凋亡等信號通路。對按照“基因計數(shù)”排序的前10個KEGG條目繪制KEGG“Chord plot”來映射項目與基因歸屬關(guān)系（圖4-F）。PI3K/Akt和IL-17信號通路是最顯著富集的通路，19個SD靶點參與PI3K/Akt信號通路，形成1個包含19個節(jié)點和94條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4-G）。這些結(jié)果表明，防風活性成分對RA的多種協(xié)同作用涉及多個靶點和多種途徑。此外，防風治療RA潛在靶基因的PI3K/Akt和IL-17信號通路分別如圖5所示（紅色矩形代表潛在的靶基因）。

A-BP分析的前20個富集項的條形-氣泡圖，按調(diào)整后的值排序 B-BP分析中主要8項富集弦圖 C、D-參與激素響應(yīng)（GO：0009725）和細胞死亡的正向調(diào)節(jié)（GO：0010942）防風靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) E-KEGG分析的前20個富集途徑的條形-氣泡圖，按調(diào)整后的值排序 F-KEGG分析前10項富集途徑的弦圖，按潛在靶基因的基因數(shù)排序 G-參與PI3K/Akt信號通路的防風靶標的PPI網(wǎng)絡(luò)（hsa04151）

A-bar-bubble plot of top 20 enriched terms of BP analysis, sorted by adjustedvalue B-GO chord plot of primary enriched 8 terms of BP analysis C, D-PPI network of targets ofinvolved in response to hormone (GO: 0009725) and positive regulation of cell death (GO: 0010942) E-bar-bubble plot of top 20 enriched pathways of KEGG analysis, sorted by adjustedvalue F-KEGG chord plot of top 10 enriched pathways of KEGG analysis sorted by gene count for potential target genes G-PPI network of targets ofinvolved in PI3K/Akt signaling pathway (hsa04151)

圖4 防風治療RA靶點的GOBP和KEGG途徑富集分析

Fig. 4 GO BP and KEGG pathway enrichment analysis of targets ofagainst RA

3.1.5 IPS網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 根據(jù)獲得的KEGG通路富集分析結(jié)果，運用Cytoscape構(gòu)建IPS網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地解釋防風對RA的作用機制，并通過內(nèi)置工具分析防風靶點。如圖6-A所示，該網(wǎng)絡(luò)由104個節(jié)點和366條邊構(gòu)成，橙色節(jié)點代表防風活性成分（六邊形），綠色節(jié)點代表KEGG分析得到的前20條信號通路（正方形），紅色節(jié)點代表防風和RA（橢圓）的共同靶基因。在Cytoscape中將拓撲參數(shù)高于IPS網(wǎng)絡(luò)平均連接度、介度和緊密度的節(jié)點提取出來，得到Hithubs Network（核心網(wǎng)絡(luò)，圖6-B），這些節(jié)點是防風治療RA的核心靶點、核心成分和重要的信號通路。涉及的主要信號通路是PI3K/Akt和IL-17，核心靶點是前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase2，PTGS2）、轉(zhuǎn)錄因子p65（transcription factor p65，RELA）和AKT1等，核心成分則包括漢黃芩素、β-谷甾醇、5--甲基維斯阿米醇和別歐前胡素等。

3.1.6 靶點-器官定位網(wǎng)絡(luò)分析 評估66個防風-RA靶點的mRNA水平，所有靶蛋白的mRNA水平在BioGPS中均可用。其中有64個靶蛋白在21個與RA相關(guān)免疫器官中mRNA表達水平升高，包括滑膜（29個靶點）、脾臟（26個靶點）、淋巴結(jié)（25個靶點）、腎上腺皮質(zhì)（28個靶點）、骨髓（28個靶點）、腎皮質(zhì)（19個靶點）、腎髓質(zhì)（19個靶點）、淋巴細胞（30個靶點）、漿細胞（25個靶點）等。構(gòu)建的靶點-器官定位網(wǎng)絡(luò)，包含85個節(jié)點和549條邊（圖7）。大多數(shù)靶標在多個器官和組織中高表達，表明這些器官與防風的靶標密切相關(guān)。此外，21個器官與免疫密切相關(guān)，表明防風對RA的治療作用可能涉及全身免疫的激活。

圖6 IPS網(wǎng)絡(luò)(A) 與核心網(wǎng)絡(luò)(B) 構(gòu)建與分析

3.1.7 與RA發(fā)病機制相關(guān)的防風靶點的GEO數(shù)據(jù)集分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取感興趣的GEO數(shù)據(jù)集，分析了GSE93272數(shù)據(jù)集健康對照組和RA組中與RA發(fā)病機制相關(guān)的SD靶點的歸一化表達值。該數(shù)據(jù)集收集了大樣本RA患者和健康對照的全血基因表達水平數(shù)據(jù)，可用于分析鑒定不同人群基因的差異表達。結(jié)果表明，66個防風靶點中的38個存在差異表達，其中有10個在RA組中顯著上調(diào)，其余28個顯著下調(diào)。其中腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、CASP3、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、PTGS2和G1/S期特異細胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）是關(guān)鍵靶點（圖8-A）；維生素A與絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、RELA、周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、熱休克蛋白αB1（heat shock protein 90 kDa alpha family class B member 1，HSP90AB1）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL2）和二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）屬于IPS中的核心靶點（圖8-B）。以上結(jié)果表明，這些防風靶標與RA的發(fā)病機制密切相關(guān)。

箭頭節(jié)點代表器官，菱形節(jié)點代表靶點；節(jié)點明暗和大小與其連接度相關(guān)

3.1.8 巨噬細胞病理學(xué)相關(guān)的防風靶點的生物信息學(xué)分析 滑膜炎是RA的病理基礎(chǔ)，滑膜巨噬細胞和FLSs是RA的核心靶細胞，會導(dǎo)致骨骼和關(guān)節(jié)軟骨的破壞[4]。巨噬細胞與炎癥微環(huán)境相互作用以參與RA炎癥的發(fā)展。當被激活時，巨噬細胞會產(chǎn)生細胞因子、趨化因子、代謝物和其他參與RA過程的因子[23]。同樣地，通過分析GSE97779數(shù)據(jù)集中滑膜巨噬細胞在健康對照組和RA組的DEGs，發(fā)現(xiàn)66個防風靶點中的26個是差異表達的，包括RA中上調(diào)的18個基因和8個下調(diào)的基因（圖9-A）。這26個DEGs的表達式模式的熱圖見圖9-B。25個防風靶點參與巨噬細胞病理學(xué)，形成1個包含25個節(jié)點和105條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中TNF、IL6、CASP3、CCND1、MAPK14、纖連蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N1）、PTGS2和RELA是發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵靶點（圖9-C）。為了進一步分析這些參與巨噬細胞病理學(xué)的目標，進行了GO和KEGG通路富集分析以進行功能預(yù)測。主要在靶標中富集的GO BP條目包括對激素的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、細胞死亡的正向調(diào)節(jié)等（圖9-D）。在KEGG通路分析中，這26個防風靶點在IL-17、PI3K/Akt、RA和凋亡等信號通路高度富集。上述結(jié)果表明，這些防風靶點與巨噬細胞病理學(xué)密切相關(guān)，在RA發(fā)病機制的相關(guān)病理過程中發(fā)揮著重要的作用。

A-PPI網(wǎng)絡(luò)中防風治療RA關(guān)鍵靶點表達 B-IPS網(wǎng)絡(luò)中核心靶點表達

A-DEGs和防風治療RA的共同靶點，每個氣泡點的大小表示相應(yīng)的P值 B-26個DEGs的表達模式熱圖 C-參與巨噬細胞病理學(xué)的25個防風靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) D-巨噬細胞病理學(xué)相關(guān)靶標的GO BP和KEGG通路富集分析，BP和KEGG分析的前20個富集項的氣泡圖，按?lgP排序

3.1.9 通過分子對接檢測核心成分與核心靶標之間的結(jié)合能力 在IPS核心網(wǎng)絡(luò)中共有8個活性成分和10個關(guān)鍵靶點，最終得到40組配體-受體對接結(jié)果?；谟H和力分數(shù)的對接結(jié)果見圖10，所有對接組合的結(jié)合能均小于?20.929 3 kJ/mol，其中得分最低的是漢黃芩素-AKT1對接組合，得分為?26.370 9 kJ/mol，最高的是紫花前胡素-PTGS2對接組合，得分為?47.300 1 kJ/mol。配體-受體結(jié)合構(gòu)象結(jié)合能越低，表明構(gòu)象越穩(wěn)定，則互作的可能性也越大。分子對接結(jié)果顯示所有對接組合均具有較強的對接活性，表明這些核心活性成分可能通過核心靶點在RA的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對接分數(shù)排名前5的分子對接三維視圖如圖11所示。

3.2 實驗驗證

3.2.1 別歐前胡素抑制細胞活力、遷移和侵襲及細胞因子和MMPs的表達，并誘導(dǎo)細胞凋亡 在Hithubs Network中排名前4的核心成分是漢黃芩素（26）、β-谷甾醇（567）、5--甲基維斯阿米醇（11）和別歐前胡素（3），前3個并不是防風的特異性成分，因此選擇僅在3種（括號中數(shù)字）中藥中分布的別歐前胡素作進一步的深入驗證機制研究。

圖10 防風的8個核心成分與10個關(guān)鍵靶點的對接得分

如圖12-A所示，在MH7A細胞中干預(yù)24 h后，別歐前胡素（60、80、120、160 μmol/L）和MTX（20 μmol/L）明顯抑制細胞活力（＜0.05、0.01）；在處理48 h后，別歐前胡素（80、120、160 μmol/L）和MTX（20 μmol/L）明顯抑制細胞活力（＜0.01）。在MH7A細胞中選擇濃度為20、40、60 μmol/L的別歐前胡素進行后續(xù)實驗。別歐前胡素和MTX顯著抑制MH7A細胞的遷移和侵襲（＜0.05、0.01，圖12-B）；別歐前胡素和MTX均顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細胞中、、、和的mRNA表達水平（＜0.01，圖12-C）；別歐前胡素（40、60 μmol/L）和MTX顯著誘導(dǎo)MH7A細胞凋亡（＜0.05、0.01，圖12-D）。

圖11 按對接分數(shù)排序的前5種分子對接組合的3D視圖

A-別歐前胡素和MTX作用24、48 h對細胞活力的影響 B-別歐前胡素和MTX對細胞遷移和侵襲的影響 C-別歐前胡素和MTX對TNF-α誘導(dǎo)的細胞炎癥因子基因表達的影響 D-別歐前胡素和MTX對細胞凋亡的影響 與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；與TNF-α組比較：##＜0.01；與MTX組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01

A-effects of prangenidin and MTX for 24 and 48 h on cell viability B-effects of prangenidin and MTX on cell migration and invasion C-effects of prangenidin and MTX on inflammatory factors gene expressions in TNF-α-induced cells D-effects of prangenidin and MTX on cell apoptosis*< 0.05**< 0.01control group;##< 0.01TNF-α group;▲< 0.05▲▲< 0.01MTX group

圖12 別歐前胡素對MH7A細胞生物學(xué)行為的影響

Fig. 12 Effect of prangenidin on biological behavior of MH7A cells

3.2.2 別歐前胡素通過抑制PI3K/Akt通路對MH7A細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果表明別歐前胡素治療RA的機制與PI3K/Akt通路和細胞死亡的調(diào)控生物過程相關(guān)，潛在靶基因包括Bax、Bcl-2等與細胞凋亡相關(guān)的蛋白。為了闡明別歐前胡素改善RA的機制，采用Western blotting分析相關(guān)蛋白表達。TNF-α（10 ng/mL）誘導(dǎo)后p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt值顯著升高（＜0.01，圖13-A），別歐前胡素（40 μmol/L）作用后顯著降低了p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt值（＜0.01）。然后，使用PI3K抑制劑LY294002檢測其對細胞遷移和侵襲、細胞凋亡、細胞因子和MMPs表達的調(diào)控作用，并檢測凋亡相關(guān)蛋白表達。LY294002（20 μmol/L）顯著抑制MH7A細胞遷移和侵襲（＜0.01，圖13-B），并顯著降低TNF-α（10 ng/mL）誘導(dǎo)的MH7A細胞中、、、和的mRNA表達水平（＜0.01，圖13-C）。別歐前胡素（40 μmol/L）和LY294002（20 μmol/L）顯著誘導(dǎo)MH7A細胞凋亡（＜0.05、0.01，圖13-D），下調(diào)Bcl-xL并上調(diào)Bax、cleaved Caspase-3表達（＜0.01，圖13-E）。

A-別歐前胡素對TNF-α誘導(dǎo)的細胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達的影響 B-LY294002對細胞遷移和侵襲的影響 C-LY294002對TNF-α誘導(dǎo)的細胞炎癥因子基因表達的影響 D-別歐前胡素和LY294002對細胞凋亡的影響 E-別歐前胡素和LY294002對細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；與TNF-α組比較：##＜0.01；與LY294002組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01

A-effect of prangenidin on PI3K/Akt pathway related protein expressions in TNF-α-induced cells B-effect of LY294002 on cell migration and invasion C-effect of LY294002 on inflammatory factors gene expressions in TNF-α-induced cells D-effects of prangenidin and LY294002 on cell apoptosis E-effects of prangenidin and LY294002 on apoptosis related protein expressions in cells*< 0.05**< 0.01control group;##< 0.01TNF-α group;▲< 0.05▲▲< 0.01LY294002 group

圖13 別歐前胡素對MH7A細胞PI3K/Akt通路的影響

Fig. 13 Effect of prangenidin on PI3K/Akt pathway in MH7A cells

4 討論

本研究系統(tǒng)地評價了防風生物活性成分的藥理、毒理和分子特性，加深了對這些防風活性成分的認識。對防風-RA共存靶點進行蛋白質(zhì)功能分類、BioGPS靶點-器官定位分析，還使用GEO數(shù)據(jù)庫中人類高通量組學(xué)數(shù)據(jù)驗證了與RA致病機制相關(guān)的防風靶點，并對別歐前胡素進行了體外實驗驗證。

通過建立和篩選IPS網(wǎng)絡(luò)得到核心成分漢黃芩素、β-谷甾醇、5--甲基維斯阿米醇和別歐前胡素等，核心靶點PTGS2、RELA、AKT1等。Khan等[24]研究顯示漢黃芩素可以有效抑制IL-1β刺激的軟骨細胞中IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、一氧化氮和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）炎癥介質(zhì)的表達和產(chǎn)生，通過激活相應(yīng)信號通路發(fā)揮確切的抗炎和軟骨保護作用。此外，動物實驗表明漢黃芩素通過核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路改善膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠RA癥狀，并呈劑量相關(guān)性地改善抗氧化蛋白、氧化應(yīng)激標志物和炎性細胞因子水平的變化[25]。一項對小鼠巨噬細胞的研究表明，β-谷甾醇處理后，一些趨化因子和促炎因子釋放減少，抗炎因子IL-10水平增加，并且提高了蛋白酪氨酸磷酸酶1（protein phosphoserine phosphatase-1，SHP-1）活性，抑制了信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]。其他研究表明，β-谷甾醇通過抑制NF-κB和激活血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路對CIA大鼠起到抗關(guān)節(jié)炎作用，β-谷甾醇可以通過調(diào)節(jié)巨噬細胞功能，抑制M1極化，增強M2極化從而減少促炎因子和增加抗炎因子釋放[27-28]。大量研究表明漢黃芩素、5--甲基維斯阿米醇等色原酮類化合物在各種動物模型和細胞實驗中抑制炎性細胞因子釋放和炎癥相關(guān)信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[29-30]。以上研究充分說明防風活性成分在RA的治療中有很好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。此外，既往大量文獻研究表明這些核心靶點在RA的治療和發(fā)病機制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[31-33]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)可以看出66個靶點間并非相互獨立，而是呈現(xiàn)相互作用的交互關(guān)系[34]。在成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中，很多靶基因可以被防風的多種活性成分調(diào)控，這體現(xiàn)了中醫(yī)藥療法多成分、多靶點的特質(zhì)。進一步對66個靶基因進行了GO BP和KEGG通路富集分析。其中PI3K/Akt和IL-17是IPS核心網(wǎng)絡(luò)中的主要信號通路。和既往的研究一致[35]，表明這些信號通路在RA疾病的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響。研究表明，阻斷PI3K/Akt通路可以抑制RA患者FLSs的腫瘤樣生物學(xué)行為[36-37]。Chang等[38]發(fā)現(xiàn)IL-17通過激活STAT3上調(diào)自噬增強了RA中FLSs的腫瘤樣增殖。IL-17在RA-FLSs中誘導(dǎo)線粒體功能障礙和自噬體形成，表明它們對細胞凋亡具有抗性。IL-17誘導(dǎo)的自噬相關(guān)抗細胞凋亡通過抑制自噬而恢復(fù)，這表明線粒體功能障礙與RA-FLSs中的細胞存活之間存在關(guān)系。輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）和IL-17通過引起線粒體功能障礙增加RA-FLSs的自噬[39]。最近一項研究總結(jié)了中藥及其活性成分對RA-FLSs的凋亡誘導(dǎo)，闡述了促凋亡治療RA的重要分子機制[40]。本研究結(jié)果表明，防風有效成分可以通過作用于多種生物學(xué)過程和信號通路發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用，從而起到對RA的治療作用。對IPS中篩選出的核心成分和核心靶點組合進行分子對接驗證，結(jié)果顯示所有對接組合均具有良好的對接活性，說明其可能在RA的治療中發(fā)揮著重要的作用。預(yù)測結(jié)果為防風中活性成分作用于特定靶點治療RA提供了依據(jù)。

在RA滑膜炎性環(huán)境中，F(xiàn)LSs會發(fā)生凋亡異常，“類腫瘤樣”異常增殖，會導(dǎo)致細胞過度活化，遷移、侵襲能力加強。RA-FLSs分泌細胞因子和免疫細胞的募集都會導(dǎo)致PI3K/Akt通路的高度激活，并進一步參與RA-FLSs的異常生物學(xué)行為和炎癥，導(dǎo)致炎癥性侵蝕性關(guān)節(jié)炎和TNF-α介導(dǎo)的軟骨破壞[41]。TNF-α刺激T細胞產(chǎn)生巨噬細胞集落刺激因子，激活成骨細胞產(chǎn)生核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），間接誘導(dǎo)破骨細胞的產(chǎn)生[42]。被PI3K激活的Akt能夠通過磷酸化作用抑制或激活其下游死亡啟動子相關(guān)靶蛋白Bcl-xL/Bcl-2從而影響細胞凋亡[35]。別歐前胡素是一種香豆素類生物活性化合物，既往研究表明，其具有抗腫瘤活性、抗氧化、抗炎，以及誘導(dǎo)激活細胞凋亡、鐵死亡、氧化死亡以抑制細胞生長和遷移、侵襲等多種藥理學(xué)作用[43-47]。但目前為止，有關(guān)該化合物的研究很少，其對RA-FLSs的異常生物學(xué)行為影響的研究尚無報道。在本研究中，首次闡述了別歐前胡素可以抑制MH7A細胞的活力、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡，也能抑制、、、和的表達，這可能是別歐前胡素治療RA的機制。分子分析表明別歐前胡素通過抑制PI3K/Akt通路發(fā)揮對MH7A細胞的調(diào)控作用。

本研究通過以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)的研究方法，系統(tǒng)地闡明了防風治療RA的分子靶點和潛在機制。構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，篩選出防風治療RA的核心成分和關(guān)鍵靶點及其作用的方式，以及對活性成分-靶點進行分子對接驗證，為揭示防風治療RA的分子生物學(xué)機制和藥物研發(fā)提供了進一步的理論依據(jù)。體外實驗研究結(jié)果表明，別歐前胡素是通過抑制PI3K/Akt通路的分子機制在RA治療中發(fā)揮作用的一種新的有價值的天然潛在藥物。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Radu A F, Bungau S G. Management of rheumatoid arthritis: An overview [J]., 2021, 10(11): 2857.

[2] Guo Q, Wang Y X, Xu D,. Rheumatoid arthritis: Pathological mechanisms and modern pharmacologic therapies [J]., 2018, 6: 15.

[3] Baum R, Gravallese E M. Bone as a target organ in rheumatic disease: Impact on osteoclasts and osteoblasts [J]., 2016, 51(1): 1-15.

[4] Cheng L Y, Wang Y Y, Wu R H,. New insights from single-cell sequencing data: Synovial fibroblasts and synovial macrophages in rheumatoid arthritis [J]., 2021, 12: 709178.

[5] Serratì S, Margheri F, Chillà A,. Reduction ofinvasion andcartilage degradation in a SCID mouse model by loss of function of the fibrinolytic system of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts [J]., 2011, 63(9): 2584-2594.

[6] Bartok B, Firestein G S. Fibroblast-like synoviocytes: Key effector cells in rheumatoid arthritis [J]., 2010, 233(1): 233-255.

[7] Nygaard G, Firestein G S. Restoring synovial homeostasis in rheumatoid arthritis by targeting fibroblast-like synoviocytes [J]., 2020, 16(6): 316-333.

[8] Noss E H, Brenner M B. The role and therapeutic implications of fibroblast-like synoviocytes in inflammation and cartilage erosion in rheumatoid arthritis [J]., 2008, 223(1): 252-270.

[9] Bao Z Z, Zhu Z Y, Zhang H J,. The complete chloroplast genome of[J]., 2019, 5(1): 360-361.

[10] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 156.

[11] 梁瑞峰, 李兵杰, 葛文靜, 等. 防風不同提取部位的燥性差異及其對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜水通道蛋白的影響 [J]. 中草藥, 2021, 52(11): 3312-3320.

[12] Chun J M, Kim H S, Lee A Y,. Anti-inflammatory and antiosteoarthritis effects ofethanol extract:andstudies [J]., 2016, 2016: 1984238.

[13] Tai J, Cheung S. Anti-proliferative and antioxidant activities of[J]., 2007, 18(1): 227-234.

[14] Yang M, Wang C C, Wang W L,.-an ethnopharmacological, phytochemical and pharmacological review [J]., 2020, 26(11): 873-880.

[15] Kreiner J, Pang E, Lenon G B,.: A phytochemical, pharmacological, and pharmacokinetic review [J]., 2017, 15(4): 255-264.

[16] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[17] Berger S I, Iyengar R. Network analyses in systems pharmacology [J]., 2009, 25(19): 2466-2472.

[18] Kitchen D B, Decornez H, Furr J R,. Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: Methods and applications [J]., 2004, 3(11): 935-949.

[19] Shen X, Zhao Z Y, Wang H,. Elucidation of the anti-inflammatory mechanisms ofandusing system pharmacological analyses [J]., 2017, 2017: 3709874.

[20] Gaillard T. Evaluation of AutoDock and AutoDock vina on the CASF-2013 benchmark [J]., 2018, 58(8): 1697-1706.

[21] Liu X, Shi F, Li Y,. Post-translational modifications as key regulators of TNF-induced necroptosis [J]., 2016, 7(7): e2293.

[22] Alpízar-Rodríguez D, Pluchino N, Canny G,. The role of female hormonal factors in the development of rheumatoid arthritis [J].(), 2017, 56(8): 1254-1263.

[23] Yang X Z, Chang Y, Wei W. Emerging role of targeting macrophages in rheumatoid arthritis: Focus on polarization, metabolism and apoptosis [J]., 2020, 53(7): e12854.

[24] Khan N M, Haseeb A, Ansari M Y,. Wogonin, a plant derived small molecule, exerts potent anti-inflammatory and chondroprotective effects through the activation of ROS/ERK/Nrf2 signaling pathways in human Osteoarthritis chondrocytes [J]., 2017, 106: 288-301.

[25] Huang Y T, Guo L B, Chitti R,. Wogonin ameliorate complete Freund’s adjuvant induced rheumatoid arthritis via targeting NF-κB/MAPK signaling pathway [J]., 2020, 46(2): 283-291.

[26] Valerio M, Awad A B. β-Sitosterol down-regulates some pro-inflammatory signal transduction pathways by increasing the activity of tyrosine phosphatase SHP-1 in J774A.1 murine macrophages [J]., 2011, 11(8): 1012-1017.

[27] Zhang F, Liu Z Y, He X J,. β-Sitosterol-loaded solid lipid nanoparticles ameliorate complete Freund’s adjuvant-induced arthritis in rats: Involvement of NF-кB and HO-1/Nrf-2 pathway [J]., 2020, 27(1): 1329-1341.

[28] Liu R, Hao D L, Xu W Y,. β-Sitosterol modulates macrophage polarization and attenuates rheumatoid inflammation in mice [J]., 2019, 57(1): 161-168.

[29] Kong X Y, Liu C F, Zhang C,. The suppressive effects of(Fangfeng) chromone extract on rheumatoid arthritis via inhibition of nuclear factor-κB and mitogen activated proteinkinases activation on collagen-induced arthritis model [J]., 2013, 148(3): 842-850.

[30] Okuyama E, Hasegawa T, Matsushita T,. Analgesic components ofroot () [J].(), 2001, 49(2): 154-160.

[31] Fan H W, Liu G Y, Zhao C F,. Differential expression of COX-2 in osteoarthritis and rheumatoid arthritis [J]., 2015, 14(4): 12872-12879.

[32] Giridharan S, Srinivasan M. Mechanisms of NF-κB p65 and strategies for therapeutic manipulation [J]., 2018, 11: 407-419.

[33] Che N, Sun X X, Gu L,. Adiponectin enhances B-cell proliferation and differentiation via activation of Akt1/STAT3 and exacerbates collagen-induced arthritis [J]., 2021, 12: 626310.

[34] Zeng Q, Li L F, Jin Y,. A network pharmacology approach to reveal the underlying mechanisms ofPall. on the treatment of Alzheimer’s disease [J]., 2019, 2019: 8706589.

[35] Liu S, Ma H X, Zhang H X,. Recent advances on signaling pathways and their inhibitors in rheumatoid arthritis [J]., 2021, 230: 108793.

[36] Liu Y, Pan Y F, Xue Y Q,. uPAR promotes tumor-like biologic behaviors of fibroblast-like synoviocytes through PI3K/Akt signaling pathway in patients with rheumatoid arthritis [J]., 2018, 15(2): 171-181.

[37] Song B, Li X F, Yao Y,. BMP9 inhibits the proliferation and migration of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis via the PI3K/AKT signaling pathway [J]., 2019, 74: 105685.

[38] Chang L, Feng X, Gao W. Proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes is enhanced by IL-17-mediated autophagy through STAT3 activation [J]., 2019, 60(4): 358-366.

[39] Kim E K, Kwon J E, Lee S Y,. IL-17-mediated mitochondrial dysfunction impairs apoptosis in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through activation of autophagy [J]., 2017, 8(1): e2565.

[40] Zhang Q, Liu J, Zhang M M,. Apoptosis induction of fibroblast-like synoviocytes is an important molecular-mechanism for herbal medicine along with its active components in treating rheumatoid arthritis [J]., 2019, 9(12): 795.

[41] Liu S Y, Cao C X, Zhang Y J,. PI3K/Akt inhibitor partly decreases TNF-α-induced activation of fibroblast-like synoviocytes in osteoarthritis [J]., 2019, 14(1): 425.

[42] Chen X J, Chen W, Aung Z M,. LY3023414 inhibits both osteogenesis and osteoclastogenesis through the PI3K/Akt/GSK3 signalling pathway [J]., 2021, 10(4): 237-249.

[43] Bai Y Y, Yang L J, Zhang C H,. Studies on the mechanism of alloimperatorin on the proliferation and apoptosis of HeLa cells [J]., 2021, 2021: 6617312.

[44] Abd-Alla H I, Ibrahim Fouad G, Ahmed K A,. Alloimperatorin fromfruits mitigates Piroxicam-provoked gastric ulcer and hepatorenal toxicity in ratssuppressing oxidative stress and apoptosis [J]., 2022, 27(8): 727-742.

[45] Bai Y Y, Cheng Y M, Wang W H,.andstudies of alloimperatorin induced autophagy in cervical cancer cells via reactive oxygen species pathway [J]., 2022, 13(6): 14299-14314.

[46] Zhang J, Gao R F, Li J,. Alloimperatorin activates apoptosis, ferroptosis, and oxeiptosis to inhibit the growth and invasion of breast cancer cells[J]., 2022, 100(3): 213-222.

[47] Li H, Chao X, He C-LAlloimperatorin and its epoxide derivative exhibit in vitro antitumor activity in HL-60 acute myeloid leukemia cancer cells via inducing apoptosis, cell cycle disruption and inhibition of cell migration [J]., 2016, 11(1): 194-199.

Bioactive components inand its mechanism on rheumatoid arthritis based on network pharmacology

JIANG Yong1, 2, ZHONG Shu-xin3, HE Sheng-hua4, LIANG Jia-bin1, 2, ZHANG Hao-yu1, 2, YE Yu-feng2, CHEN Han-wei2, 5

1. Guangzhou Panyu Central Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. Central Laboratory, Guangzhou Panyu Central Hospital, Guangzhou 511486, China 3. School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, China 4. The Fourth Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518033, China 5. Guangzhou Panyu Health Management Center, Guangzhou 511495, China

To investigate the molecular biological mechanism ofin treating rheumatoid arthritis (RA) through a pharmacology-based strategy.The bioactive phytochemicals ofand potential targets for the treatment of RA were screened by network pharmacology, and phytochemicals-related parameters such as pharmacology and toxicology were evaluated. The protein interaction network was established to screen the core targets, and the correlation between the core targets and RA was further validated by bioinformatics strategy. Finally, molecular docking of core components and corresponding targets was performed. CCK-8 assay, cell migration and invasion, cell apoptosis, qRT-PCR, and Western blotting analysis were performed to clarify the regulation of prangenidin on phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) pathway in MH7A cells.A total of 18 bioactive phytochemicals and 66 potential target genes intersecting with the screened RA disease target genes were identified from. Finally, core ingredients such as wogonin, β-sitosterol, 5--methylvisamminol and prangenidin were obtained. The underlying mechanism ofin treating RA might be achieved by regulating pathways such as PI3K/Akt, interleukin-17 (IL-17), apoptosis and multiple biological processes to exert anti-inflammatory and immunomodulatory effects. Molecular docking confirmed that all core ingredients and key targets had great docking activity. Prangenidin inhibited viability, migration and invasion (< 0.05, 0.01), induced apoptosis in MH7A cells (< 0.01), and significantly down-regulated,,, matrix metalloproteinase-1 () andgene expressions (< 0.01). Molecular analysis showed that prangenidin exerts its regulatory effect on MH7A cells by inhibiting PI3K/Akt pathway.This study successfully predict the effective components and potential targets ofin the treatment of RA, which provide a new theoretical basis for further exploring its molecular mechanism. It is revealed that prangenidin inhibits the activity, migration, invasion and expressions of cytokines and MMPs of RA fibroblast-like synovial cells through PI3K/Akt pathway, and induces cell apoptosis.

(Turcz.) Schischk; rheumatoid arthritis; network pharmacology; pathogenesis mechanism; prangenidin; wogonin; 5--methylvisamminol; fibroblast-like synoviocytes; PI3K/Akt signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)17 - 5601 - 18

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.014

2023-04-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（8217150266）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81729003）；廣州市衛(wèi)生健康委員會科技項目（20211A011114）；廣州市番禺區(qū)科技計劃重大項目（2022-Z04-114）

蔣 勇，博士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究。E-mail: 20202120219@stu.gzucm.edu.cn

葉裕豐，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: 838554325@qq.com

陳漢威，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: docterwei@sina.com

[責任編輯 李亞楠]