杜雨欣,鄭保海,李佳欣,李玉鑫,黃立成,施軍瓊,吳忠興

(1:西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點實驗室,重慶 400715) (2:昆明市滇池高原湖泊研究院,昆明 650228)

自工業(yè)革命開始,化石燃料的使用快速增加,同時伴隨著亂砍濫伐、過度開墾等環(huán)境問題的發(fā)生,使得大氣中的CO2濃度以前所未有的速度持續(xù)增加,預(yù)計將在21世紀末超過0.08%(V/V)[1]。CO2作為光合作用的主要原料,在藻類的繁殖和生長中發(fā)揮著重要作用[2]。而大氣中CO2濃度的升高會影響海洋和湖泊等水體表面的CO2氣體交換,使得水體環(huán)境發(fā)生變化,影響水體中浮游植物細胞的新陳代謝過程,進而對水生生態(tài)系統(tǒng)和生物地球化學(xué)循環(huán)產(chǎn)生深遠影響[3]。因而,關(guān)于浮游植物應(yīng)對大氣CO2濃度升高的生理和生態(tài)響應(yīng)一直是熱點問題[4-6],但是目前的相關(guān)研究較多集中于海洋浮游植物,而關(guān)于大氣CO2濃度升高對淡水藻類生長的具體作用研究甚少[7]。

因此,本研究在云南滇池對微囊藻水華過程進行跟蹤采樣,分析微囊藻水華前、中、后和末期CCM基因型的動態(tài)變化特征,并在室內(nèi)模擬低、中和高3種CO2濃度條件,分析不同CCM基因型的微囊藻對外界環(huán)境中CO2濃度變化的適應(yīng)策略,旨在探究自然水體條件下CCM微進化與微囊藻種群演替的關(guān)系,進而為揭示環(huán)境CO2升高對微囊藻水華演替和發(fā)展以及水華形成機制提供重要的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況與樣品采集

滇池(24°40′～25°02′N,102°36′～102°40′E) 位于云貴高原,屬亞熱帶高原季風(fēng)氣候。年平均氣溫15℃。平均水域面積310 km2,平均水深4.7 m,流域面積2920 km2。滇池被海埂大堤劃分為草海和外海兩部分。其中外海占湖區(qū)總面積的96.7%。本研究分別在外海的4個方位設(shè)置了4個采樣點(圖1)。分別是東大河(DDH)、觀音山(GYS)、洛龍河(LLH)和生態(tài)所(STS)。于2021年5-11月的每月采集水樣1～2次。使用水樣采集器采集表層水樣(距水面0.5 m),重復(fù)采樣3次,混合后立即放入冰盒中于當天帶回實驗室做進一步分析。

圖1 滇池采樣點分布示意Fig.1 Distributions of sampling sites at Lake Dianchi

1.2 水體理化指標的測定

1.3 基因組DNA的提取

取250 mL混勻后的水樣經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾,含藻濾膜于-80℃冰箱中凍存。濾膜剪碎后采用改良CTAB法提取DNA[11]。

1.4 擴增引物及熒光定量PCR標準曲線的構(gòu)建

本研究所選用的引物如表1所示。其中引物對16S-F/16S-R和引物對sbtA-F2/sbtA-R2由Giovanni等設(shè)計[12-13],分別用于特異性擴增微囊藻的16S rDNA基因和sbtA基因。引物對bicA-F/bicA/R通過軟件DNAMAN設(shè)計,用于特異性擴增微囊藻bicA基因。所有引物由生工生物技術(shù)有限公司合成。3個基因片段的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,對目的條帶進行膠回收。純化后的產(chǎn)物通過TA克隆與PMD-19T載體連接,并轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coli細胞DH5α 中。挑取陽性克隆過夜搖菌,采用質(zhì)粒小體試劑盒(天根,北京)提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒線性化片段溶于ddH2O制備成標準品。采用微量分光光度計NanoDrop 1000(Thermo,美國)測定標準品中的質(zhì)粒濃度。標準品基因拷貝數(shù)(copies/mL)=質(zhì)粒濃度×10-9×6.02×1023/[質(zhì)粒長度(bp)+目的片段(bp)×660]。將制備的標準品10倍梯度稀釋構(gòu)建標準曲線。3條標準曲線擴增效率分別為85.71%、94.61%和89.34%。

表1 本研究所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

1.5 熒光定量PCR

定量PCR反應(yīng)體系為20 μL,其中含有TB GreenPremix Ex TaqII 10 μL、ROX Reference Dye II 0.4 μL,上下游引物各0.8 μL、DNA模板2 μL,超純水6 μL。反應(yīng)程序如下:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性10 s,52℃退火30 s,72℃ 15 s,40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)測定3次。將得到的Ct值代入標準曲線計算樣品中16S rDNA、bicA和sbtA基因的拷貝數(shù)。以微囊藻16S rDNA基因的拷貝數(shù)表征水體微囊藻總量,以bicA和sbtA基因拷貝數(shù)與16S rDNA拷貝數(shù)的比值表征兩種基因型微囊藻的相對豐度。

1.6 藻種培養(yǎng)與室內(nèi)實驗設(shè)計

實驗所用微囊藻藻株FACHB-908(sbtA型)來自中國科學(xué)院淡水藻種庫,A5(bicA型)分離自三峽水庫,純化后的微囊藻藻種于MA培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度(25±1)℃,光照強度30 μmol protons /(m2·s),光照周期12 h∶12 h(光照∶黑暗)。

實驗將等生物量的兩種CCM基因型的微囊藻分別在濃度為0.02%、0.04%和0.08%的CO2條件下進行混合培養(yǎng)。培養(yǎng)體積為400 mL,初始藻細胞接入量為OD680=0.07,每個處理設(shè)置3個重復(fù)。不同濃度的CO2通過空氣及純氮氣以一定比例的流量混合實現(xiàn)。所有氣體進入之前均經(jīng)過0.22 μm無菌濾膜過濾,經(jīng)復(fù)合氣體分析儀檢測校正CO2濃度后用于實驗。第0、3、7、11和15天對各處理進行了取樣,樣品的DNA提取及定量PCR方法同前。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel和SPSS 24(IBM Inc., Chicago, IL, 美國)進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義,并使用Origin 2021(Origin Lab Inc.,Northampton, MA, 美國)進行繪圖。不同基因型微囊藻和環(huán)境因子Mantel 檢驗分析在R 4.2.2中使用linkET包和dplyr包進行分析和繪制[14],其中Bray-curtis距離用于物種分析,歐幾里得距離(Euclidean distance)用于環(huán)境因子分析。

2 結(jié)果

2.1 滇池各樣點葉綠素a濃度的動態(tài)變化

為確定滇池水華的發(fā)生狀況,測定了4個樣點5-11月份的葉綠素a濃度。結(jié)果顯示,滇池的葉綠素a濃度在時間上變化較大,且不同樣點的變化不一致(圖2)。根據(jù)葉綠素a濃度的變化,發(fā)現(xiàn)各樣點均有水華的發(fā)生,其發(fā)生的時間和程度在不同樣點間有著一定的差異,但最大值都超過了150 μg/L(圖2)。根據(jù)Wu[15]的研究,將葉綠素濃度高于150 μg/L的月份劃定為水華中期,8-9月為水華后期,10-11月為水華末期。

圖2 不同時期滇池各采樣點的葉綠素a濃度Fig.2 Chl.a concentration at different sampling points in Lake Dianchi at different periods

2.2 滇池不同樣點無機碳濃度的動態(tài)變化

圖3 水華過程中滇池各樣點的無機碳濃度變化(a:東大河(DDH); b:觀音山(GYS); c:洛龍河(LLH); d:生態(tài)所(STS))Fig.3 Changes in inorganic carbon concentration at different locations in Lake Dianchi during bloom

2.3 滇池不同基因型微囊藻在水華過程中的競爭

對滇池中不同基因型微囊藻鑒定的結(jié)果顯示。在滇池的各樣點中,不同基因型微囊藻的相對豐度在空間上具有一定的差異,并且在整個水華過程中sbtA基因型微囊藻和bicA基因型微囊藻的變化趨勢相反。相同的是,sbtA基因型微囊藻在各樣點中始終占據(jù)絕對優(yōu)勢,相對豐度遠遠高于bicA基因型微囊藻(圖4)。在整個水華過程中,除STS外,滇池的bicA基因型微囊藻的相對豐度表現(xiàn)出了先降低后升高的趨勢,DDH與LLH的結(jié)果相一致,最小值均出現(xiàn)在水華中期,且顯著低于其它3個時期,水華后期顯著低于末期(P<0.05,圖4a和c);GYS的最小值出現(xiàn)在水華后期,與水華中期無顯著差異,但顯著低于水華前和末期(P<0.05,圖4b);STS的變化趨勢與其他樣點不同,bicA基因型微囊藻的相對豐度逐漸降低,水華后、末期具有最小值,且顯著低于前、中期(P<0.05,圖4d)。對于sbtA基因型微囊藻,其相對豐度表現(xiàn)出的趨勢則恰恰相反,DDH和STS表現(xiàn)一致,在水華中期達到最大并顯著高于另外3個時期(P<0.05,圖4a和d);GYS則表現(xiàn)為水華中、后期顯著高于水華末期(P<0.05,圖4b);LLH同樣也是在水華中期達到最大值,且顯著高于水華后期(P<0.05,圖4c)。

2.4 理化因子對水華過程中不同基因型微囊藻的影響

為探究水體理化因子與bicA基因型和sbtA基因型微囊藻之間的關(guān)系,經(jīng)Mantel 檢驗分析發(fā)現(xiàn),在不同的水華時期,與兩種基因型微囊藻顯著相關(guān)的理化因子并不一致,且多表現(xiàn)出與sbtA基因型微囊藻顯著相關(guān)(圖5)。結(jié)果顯示,在水華前期,bicA基因型微囊藻與Chl.a和TP的相關(guān)性系數(shù)較高,分別為0.59和-0.41,但并無顯著性差異(圖5a),sbtA基因型微囊藻則與Chl.a呈顯著正相關(guān)(r=0.57,P<0.05,圖5a);水華中期的bicA基因型微囊藻僅與Alk相關(guān)性較高但不顯著(r=0.36,圖5b),sbtA基因型微囊藻則與Alk呈顯著正相關(guān)(P<0.05,圖5b);在水華后期,bicA基因型微囊藻與TN顯著正相關(guān)(P<0.05,圖5c),而無理化因子與sbtA基因型微囊藻顯著相關(guān)(圖5c);水華末期與sbtA基因型微囊藻顯著相關(guān)的理化因子有pH和CO2(aq)(P<0.05,圖5d),并無與bicA基因型微囊藻顯著相關(guān)的理化因子。對整個水華期兩種基因型微囊藻和理化因子的Mantel 檢驗分析結(jié)果顯示sbtA基因型微囊藻與pH和CO2(aq)顯著正相關(guān),bicA基因型微囊藻與Chl.a顯著正相關(guān)(P<0.05,圖5e);結(jié)果還表明CT與sbtA基因型微囊藻負相關(guān),與bicA基因型微囊藻正相關(guān)。

圖5 在不同水華期理化因子與兩種基因型微囊藻的相關(guān)性分析(a、b、c、d、e分別代表水華前、中、后、末期、整個水華時期)Fig.5 Correlation analysis between physicochemical factors and two genotypes of Microcystis at different bloom stages

2.5 不同基因型微囊藻對不同濃度CO2的響應(yīng)

為了進一步探究不同基因型微囊藻對CO2的響應(yīng),使用針對微囊藻的特異性引物對不同組合微囊藻的DNA進行熒光定量PCR。結(jié)果顯示,在不同濃度CO2處理下bicA和sbtA兩種基因型微囊藻的基因拷貝數(shù)在培養(yǎng)過程中均出現(xiàn)了明顯分異(圖6)。在低濃度CO2處理組中,sbtA型的微囊藻基因拷貝數(shù)從共培養(yǎng)開始至結(jié)束逐漸升高且始終顯著高于bicA基因型微囊藻(P<0.001),具有絕對優(yōu)勢,而bicA基因型微囊藻一直保持比較低的數(shù)量(圖6);在中濃度CO2處理組中,sbtA型的微囊藻隨著共培養(yǎng)時間的增加,其基因拷貝數(shù)也增加,同樣顯著高于bicA基因型微囊藻(P<0.001)(圖6);在高濃度CO2處理組中,兩種基因型微囊藻的基因拷貝數(shù)均隨著共培養(yǎng)時間的增加而增加,并且從第3天開始發(fā)生明顯的分異,第3天以前是sbtA型微囊藻占多數(shù),第3天以后則是bicA基因型微囊藻占絕對優(yōu)勢,其基因拷貝數(shù)要顯著高于sbtA型微囊藻(P<0.05)。因此,隨著CO2濃度的降低,處于競爭中的不同基因型微囊藻會發(fā)生從bicA基因型占優(yōu)勢到sbtA基因型占優(yōu)勢的轉(zhuǎn)變。

圖6 bicA 和sbtA 基因型微囊藻在不同濃度CO2處理下的競爭響應(yīng)(a、b、c分別為兩種基因型藻株在0.08%、0.04%、0.02% CO2濃度下的競爭;*表示0.01

3 討論

CO2作為藍藻光合作用的重要原料,對藍藻尤其是具有不同CCM機制的微囊藻水華的形成具有重要的影響。滇池作為云南省內(nèi)最大的淡水湖頻繁暴發(fā)藍藻水華[16-17],已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。

3.1 滇池不同水華期CCM基因型微囊藻的動態(tài)變化

不同水華期滇池CCM微囊藻特異性引物熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖4),滇池中所有采樣點的sbtA基因型相對豐度均高于bicA基因型微囊藻,占絕對優(yōu)勢。這與曾佳穎等[20]對滇池不同CCM基因型微囊藻的研究結(jié)果一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與水體中低CO2濃度有關(guān),已有研究發(fā)現(xiàn)低濃度CO2條件下更有利于sbtA基因型微囊藻獲得競爭優(yōu)勢[21],促使bicA基因型向sbtA基因型微囊藻的轉(zhuǎn)化[22]。

3.2 環(huán)境因子對不同CCM基因型微囊藻的影響

滇池水華前中后末期理化因素對不同CCM基因型微囊藻的相關(guān)性分析結(jié)果顯示(圖5),在野外條件下微囊藻的生長受到除無機碳外的其他理化因素的影響。在水華早期,Chl.a與bicA基因型正相關(guān),與sbtA基因型顯著正相關(guān)。由于Chl.a濃度能反映浮游植物的生物量[27],說明滇池中的浮游植物以微囊藻為主,尤其是sbtA基因型微囊藻(圖5a),這與2.3節(jié)的結(jié)果中滇池sbtA基因型微囊藻在微囊藻中占絕對優(yōu)勢一致。

sbtA基因型微囊藻在水華中期與Alk顯著正相關(guān),bicA基因型微囊藻在水華中后期也與Alk相關(guān)程度很高,并且與TN顯著正相關(guān)(圖5b和5c)。偏堿性的環(huán)境和充足的氮源更有利于微囊藻的生長[19,28]。浮游植物在水華中期的大量生長導(dǎo)致了CO2濃度的大幅下降,CO2和氮磷營養(yǎng)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的同化增加了水華發(fā)展過程中的堿度和pH值[29-30]。pH值和堿度的增加使無機碳成分向碳酸氫鹽轉(zhuǎn)移[31],由于sbtA基因型微囊藻對碳酸氫鹽具有高親和力,因此在水華中后期sbtA基因型微囊藻的相對豐度高于水華早期和末期。

pH能夠影響微囊藻的生長[25]和水體中的無機碳[26],曾佳穎等[20]對滇池的研究發(fā)現(xiàn),pH與sbtA基因型的相對優(yōu)勢度呈正比,而與bicA基因型呈反比。而本研究發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象出現(xiàn)在滇池水華末期,并且pH與sbtA基因型微囊藻呈正比(圖5d)。在滇池水華末期水體中的pH均值(8.6)低于水華中后期(8.7和8.8),CO2濃度的增加引起了水體pH的下降[32],使水華末期sbtA基因型微囊藻豐度降低(圖4)。同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在對滇微囊藻和理化因子的整體Mantel 檢驗分析中。同時在對滇池整體的分析中還發(fā)現(xiàn)CT的濃度和sbtA基因型微囊藻負相關(guān),與bicA基因型微囊藻正相關(guān)(圖5e)。這和先前研究發(fā)現(xiàn)sbtA基因型微囊藻在低CT條件下會更好的生長,但在較高的CT環(huán)境中則生長較差;反之,bicA基因型微囊藻在低CT環(huán)境下生長較差,但在高CT條件下表現(xiàn)良好的實驗結(jié)果一致[20]。同時在研究中還發(fā)現(xiàn)水體中CO2濃度的升高同樣也有利于sbtA基因型微囊藻的生長,可能的原因是CO2作為光合作用的重要原料,其濃度的升高對微囊藻的生長和繁殖具有促進作用。通過對兩種基因型微囊藻和環(huán)境變量之間的相關(guān)性分析結(jié)果可知,不同CCM基因型微囊藻對不同無機碳的利用相對復(fù)雜,基本和先前的研究結(jié)果一致[12,21],但也出現(xiàn)像bicA基因型在生態(tài)所的4個水華時期比較特殊的情況,本研究認為這可能和環(huán)境因子、物種之間的交互作用有關(guān)。

3.3 不同CCM基因型微囊藻對不同CO2濃度響應(yīng)

4 結(jié)論

云南滇池不同采樣點之間空間差異較小。不同水華時期,sbtA基因型微囊藻始終占據(jù)絕對優(yōu)勢,隨滇池水體無機碳濃度的變化促使微囊藻基因型呈現(xiàn)bicA→sbtA→bicA轉(zhuǎn)變的趨勢,使得具有CCM機制的微囊藻能夠在生態(tài)系統(tǒng)中處于競爭優(yōu)勢。環(huán)境變量中,Chl.a濃度對水華早期的微囊藻有較強的相關(guān)性,總堿度和TN在水華中后期對兩種基因型影響較大,而pH和CO2濃度對水華后期sbtA基因型產(chǎn)生了顯著影響。室內(nèi)模擬實驗進一步驗證了高濃度CO2適合bicA生長,而sbtA基因型對低濃度CO2具有更強的適應(yīng)性。因此,CO2濃度對兩種CCM機制微囊藻的演替起著重要的調(diào)控作用。