楊玉梅 張坤曉

（1. 江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，連云港 222005；2. 江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222005）

基于液-液相變?cè)恚╨iquid-liquid phase separation）開發(fā)的激酶熒光探針（separation of phasebased activity reporter of kinase, SPARK）是近年來繼分離熒光蛋白技術(shù)（split fluorescent protein, split FP）、循環(huán)排列的熒光蛋白技術(shù)（circularly permuted fluorescent protein, cpFP）以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer, FRET）之后的第4種研究蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）的熒光探針技術(shù)［1-11]。該技術(shù)的原理是利用一對(duì)同型寡聚體小肽（四聚體小肽命名為HOTag6，六聚體小肽命名為HOTag3）的多價(jià)結(jié)合和迅速擴(kuò)增，將瞬時(shí)的PPI轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的綠色熒光的形態(tài)變化，表現(xiàn)為均勻分布的GFP綠色熒光聚集成高亮度的綠色液珠［12-15]。以檢測ERK激酶活性的ERK-SPARK探針為例，具體做法是將來源于細(xì)胞周期蛋白Cdc25C的一段可被ERK識(shí)別并被ERK磷酸化的肽段序列（未被磷酸化的肽段記為Perk，磷酸化后的肽段記為Perk-Phospho）與HOTag3（6聚體）融合，而將可識(shí)別、結(jié)合磷酸化的該肽段的WW結(jié)構(gòu)域與HOTag6（4聚體）融合，并在中間插入熒光蛋白EGFP來獲取熒光信號(hào)［16]。當(dāng)用EGF處理表達(dá)ERK-SPARK探針的細(xì)胞時(shí)，Perk被ERK磷酸化為Perk-Phospho，之后WW結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合到Perk-Phospho上。由于六聚體和四聚體的不對(duì)稱性，6×Perk-Phospho和4×WW結(jié)合后會(huì)空余出2×Perk-Phospho，這個(gè)2×Perk-Phospho又會(huì)結(jié)合4×WW，此時(shí)會(huì)空余出2×WW，如此循環(huán)往復(fù)，兩組分越聚越多，在極短的時(shí)間內(nèi)即可形成明顯的綠色液滴，聚集的熒光信號(hào)是單分子GFP亮度的30-50倍，具有很高的辨識(shí)度（圖1）。這類探針可以極高的分辨率和靈敏度在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)觀測激酶活性的動(dòng)態(tài)變化，因此理論上有較大的應(yīng)用前景，特別是在蛋白激酶抑制劑高通量篩選平臺(tái)的建立上。

但在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，SPARK探針僅能以瞬時(shí)表達(dá)的方式在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，當(dāng)采用病毒載體將編碼SPARK探針的序列整合至宿主染色體上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)一種尚不明確的機(jī)制會(huì)導(dǎo)致SPARK探針的功能完全喪失，因而限制了該技術(shù)的應(yīng)用。且SPARK探針功能的發(fā)揮蛋白表達(dá)量有密切關(guān)系，瞬時(shí)表達(dá)的不穩(wěn)定性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。CRISPR/Cas9 技術(shù)是利用Cas9 核酸酶與sgRNA組成的復(fù)合體對(duì)特異性靶點(diǎn)識(shí)別，在基因組上的特定位置對(duì)DNA進(jìn)行雙鏈剪切。發(fā)生雙鏈基因組斷裂的DNA可以通過真核細(xì)胞自然存在的非同源末端結(jié)合（NHEJ）或同源重組（HR）修復(fù)，其中同源重組修復(fù)機(jī)制可將外源片段整合到基因組指定位點(diǎn)，因此CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)可以在基因組層面實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因敲入的操作，且該技術(shù)具有效率高、研發(fā)周期短等特點(diǎn)。

為了克服使用病毒載體對(duì)SPARK探針的潛在影響，本研究利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)［17-19]，在不使用任何病毒相關(guān)載體的條件下，將ERK-SPARK熒光探針基因表達(dá)盒定點(diǎn)插入人AAVS1位點(diǎn)（位于人PPP1R12C基因第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，外源基因插入此位點(diǎn)可長期正常轉(zhuǎn)錄且不影響細(xì)胞其他基因）［20]，成功構(gòu)建了可被多西環(huán)素（doxycycline）誘導(dǎo)表達(dá)ERK-SPARK熒光探針的穩(wěn)定KYSE-150細(xì)胞株。該穩(wěn)定細(xì)胞株解決了SPARK熒光探針?biāo)矔r(shí)表達(dá)方式表達(dá)量不可控問題，將SPARK探針的序列定點(diǎn)整合至宿主染色體上，可使其長期正常轉(zhuǎn)錄且不影響細(xì)胞其他基因。為后續(xù)將SPARK技術(shù)應(yīng)用于高通量篩選蛋白激酶抑制劑奠定了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管鱗癌細(xì)胞株（KYSE-150）購于上海北諾生物科技有限公司。pX330、pUC19、pCW-Cas9、pcDNA3.1-ERK-SPARK質(zhì)粒購于Addgene。Bbs I酶、BsmB I酶、T4 DNA連接酶購自 New England Biolabs（NEB）公司。質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司。DNA提取試劑盒、In-Fusion無縫克隆試劑盒購自TaKaRa公司。Lipofectamine 2000試劑、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購自Gibco公司。兔抗GFP的單抗購自美國CST公司。辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。多四環(huán)素購自陶素化學(xué)。寡核苷酸序列由北京擎科公司合成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA寡核苷酸鏈合成 使用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具（https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）根據(jù)評(píng)分系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了3個(gè)20 bp的sgRNA（sp1、sp2 和 sp3）。分別在編碼鏈模板 5' 端添加 CACCG，非編碼鏈模板 5' 端添加AAAC，3' 端添加C。由北京擎科公司合成。設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列見表1。

表1 構(gòu)建 sgRNA 表達(dá)載體引物、基因組擴(kuò)增引物信息Table 1 PC construction of sgRNA expression vector primers and genome amplification primer information

1.2.2 CRISPR/Cas9 打靶載體構(gòu)建 用 T4 DNA 連接酶將Oligo退火形成的雙鏈二聚體與 Bbs I酶切的pX330 骨架質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于 Ampicillin 抗性的 LB瓊脂培養(yǎng)板上。挑取單菌落進(jìn)行測序鑒定，擴(kuò)增鑒定連接成功的菌液，并用質(zhì)粒抽提試劑盒提取。

1.2.3 AAVS1位點(diǎn)同源重組供體質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 供體質(zhì)粒設(shè)計(jì)的示意圖如下（圖2）。供體質(zhì)粒兩端750 bp的同源臂通過150基因組PCR獲得；Tet-On 3G表達(dá)系統(tǒng)、嘌呤霉素抗性基因序列克隆自pCW-Cas9質(zhì)粒；ERK-SPARK基因序列及突變體陰性對(duì)照克隆自pcDNA3.1-ERK-SPARK質(zhì)粒。所獲得的片段使用In-Fusion無縫克隆按圖2中的順序連接。

圖2 ERK-SPARK knock-in質(zhì)粒設(shè)計(jì)示意圖Fig. 2 Design schematic diagram of ERK-SPARK knock-in plasmid

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將150細(xì)胞接種于6孔板中，待其密度接近90%時(shí)，每孔分別轉(zhuǎn)入1 μg CRISPR/Cas9 打靶載體與1 μg的供體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入10 cm的皿中繼續(xù)培養(yǎng)兩周，之后加入2 μg/mL的嘌呤霉素，篩選出對(duì)嘌呤霉素具有抗性的細(xì)胞亞群。

1.2.5 流式細(xì)胞分選 在獲得對(duì)嘌呤霉素具有抗性的細(xì)胞亞群后，提前24 h加入2 μg/mL的dox，之后將細(xì)胞消化進(jìn)行流式細(xì)胞分選，收集GFP陽性細(xì)胞。

1.2.6 ERK-SPARK蛋白水平鑒定 將獲得的同時(shí)對(duì)嘌呤霉素具有抗性、且GFP表達(dá)陽性的細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后GFP一抗4℃孵育過夜，1×TBST 清洗后，二抗溶液室溫孵育1 h，1×TBST再次清洗后，用化學(xué)發(fā)光儀檢測ERK-SPARK熒光探針蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 ERK-SPARK熒光探針成像實(shí)驗(yàn) 將獲得的重組細(xì)胞鋪接種在96孔板中。加入終濃度為100 ng/mL終濃度的EGF，孵育10 min后置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 同源重組所構(gòu)質(zhì)粒的檢測結(jié)果

本研究中所構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)北京擎科公司測序檢測后，序列與設(shè)計(jì)圖譜完全一致。

2.2 構(gòu)建AAVS1位點(diǎn)敲入的ERK-SPARK穩(wěn)定細(xì)胞株

若ERK-SPARK基因表達(dá)盒成功插入AAVS1位點(diǎn)后，重組細(xì)胞將獲得以下性狀：（1）對(duì)嘌呤霉素的抗性，這是因?yàn)猷堰拭顾鼗蜃陨聿粠?dòng)子，由PPP1R12C基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，因此只有正確插入AAVS1位點(diǎn)的細(xì)胞才會(huì)獲得對(duì)嘌呤霉素的抗性；（2）在加入dox后可檢測到GFP熒光信號(hào)。這種設(shè)計(jì)的優(yōu)勢在于避免了單克隆細(xì)胞株的篩選，大大縮短了穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建。用嘌呤霉素和流式細(xì)胞雙重篩選的策略，排除了部分沒有發(fā)生基因重組、但被周圍具有嘌呤霉素抗性細(xì)胞所保護(hù)的假陽性細(xì)胞。對(duì)所獲得的重組細(xì)胞提取基因組DNA、并進(jìn)行PCR鑒定后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的片段大小約為6200 bp，與插入片段的大小一致（圖3）。Western blot結(jié)果（圖4）顯示，在加入dox誘導(dǎo)24 h，可以檢測到ERKSPARK融合蛋白的條帶，大小分別為51 kD與42.4 kD，與實(shí)際大小相符。熒光成像實(shí)驗(yàn)（圖5）顯示，加入dox WT誘導(dǎo)24 h，之后加入EGF激活ERK信號(hào)通路后，可觀察到ERK-SPARK的相變信號(hào)，而突變體對(duì)照組則無信號(hào)，這表明本研究所采用的構(gòu)建SPARK穩(wěn)定細(xì)胞系的方法不影響SPARK的功能。

圖3 基因組PCR檢測KYSE-150細(xì)胞株AAVS1位點(diǎn)ERK-SPARK表達(dá)Fig. 3 Genomic PCR detection of the ERK-SPARK expression at the AAVS1 locus in KYSE-150 cells

圖4 Western blot 驗(yàn)證ERK-SPARK在 KYSE-150細(xì)胞株中誘導(dǎo)表達(dá)Fig. 4 Validating the doxycycline-induced expression of the ERK-SPARK reporter in KYSE-150 cells by Western blot

圖5 EGF處理后 ERK-SPARK knock-in細(xì)胞系熒光成像（20X）Fig. 5 Fluorescence images of ERK-SPARK knock-in cells stimulated with EGF（20X）

3 討論

3.1 SPARK探針具有反應(yīng)靈敏迅速等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊

PPI介導(dǎo)了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其紊亂與心血管疾病、癌癥等重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此開發(fā)檢測PPI的熒光探針一直是生物技術(shù)領(lǐng)域重要的前沿方向之一。通過設(shè)計(jì)特定的熒光探針檢測蛋白激酶與其底物的相互作用、從而研究細(xì)胞內(nèi)的“磷酸化事件”又是這類熒光探針設(shè)計(jì)開發(fā)的熱點(diǎn)。在SPARK技術(shù)出現(xiàn)之前，熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）是較為常用的研究蛋白磷酸化修飾的工具。但FRET技術(shù)的信號(hào)強(qiáng)度弱、信噪比不高的缺點(diǎn)限制了其在活體成像及高通量篩選上的應(yīng)用?；谙喾蛛x原理開發(fā)的SPARK技術(shù)可以實(shí)時(shí)地捕獲特定靶點(diǎn)瞬間的磷酸化事件，并通過將單分子熒光蛋白快速聚集成直徑為1-2 μm大小的液滴的方式，將磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)，從而以直觀的方式對(duì)激酶活性進(jìn)行可視化的檢測和定量，是一種全新的、可實(shí)時(shí)監(jiān)測激酶活性的工具。

3.2 SPARK瞬時(shí)表達(dá)的使用方式具有弊端

盡管SPARK技術(shù)較FRET技術(shù)有諸多的優(yōu)點(diǎn)，但SPARK技術(shù)同樣存在一些明顯的缺陷。首先，由于SPARK技術(shù)的設(shè)計(jì)原理是基于液-液相分離，因此SPARK探針需要在細(xì)胞內(nèi)維持較高的表達(dá)水平才能發(fā)揮其功能，所以在構(gòu)建SPARK探針的質(zhì)粒時(shí)需采用強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)SPARK的基因表達(dá)盒、且需要有較高的細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)。其次，在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，采用任何形式的病毒載體將SPARK探針整合到宿主細(xì)胞基因組上時(shí)都將導(dǎo)致SPARK探針的失效，無法像FRET技術(shù)那樣通過慢病毒感染的方式構(gòu)建表達(dá)SPARK探針的穩(wěn)定細(xì)胞系，因此只能通過瞬轉(zhuǎn)的方式將SPARK送入細(xì)胞，在具體的應(yīng)用場景中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的不均一性，部分細(xì)胞的激酶活性將無法被檢測到，且當(dāng)應(yīng)用在激酶抑制劑的高通量篩選時(shí)會(huì)增加篩選的步驟與復(fù)雜性。最后，在設(shè)計(jì)任一激酶的SPARK探針時(shí)，需要慎重選擇、測試、優(yōu)化可被該激酶磷酸化的特異性肽段序列，以及可識(shí)別、結(jié)合磷酸化后的肽段的結(jié)構(gòu)域；若二者的親和力過高，則極易導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)，這是導(dǎo)致部分激酶無法設(shè)計(jì)為SPARK熒光探針的重要原因。

3.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)使SPARK熒光探針的使用更加穩(wěn)定可靠

本研究構(gòu)建的AAVS1位點(diǎn)插入的誘導(dǎo)型ERKSPARK穩(wěn)定細(xì)胞系規(guī)避了SPARK技術(shù)所存在的部分缺陷，通過采用多四環(huán)素誘導(dǎo)的Tet-On 3G系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了SPARK探針以可控的方式在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)，而不使用病毒載體的方式保證了SPARK探針在細(xì)胞內(nèi)功能的有效性。利用該穩(wěn)定細(xì)胞株對(duì)ERK激酶抑制劑進(jìn)行篩選，可以將小分子藥物的影響可視化，結(jié)合可視化高通量篩選儀器，以熒光信號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)細(xì)胞質(zhì)液滴成像情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可提高激酶抑制劑的篩選效率。后續(xù)，所構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系將被應(yīng)用于ERK激酶抑制劑的高通量篩及探索ERK信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究中。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)了同源重組技術(shù)，將ERK-SPARK熒光探針定點(diǎn)整合到了人AAVS1位點(diǎn)中，成功構(gòu)建了誘導(dǎo)表達(dá)型的SPARK熒光探針的穩(wěn)定細(xì)胞系。解決了SPARK探針無法通過慢病毒等方式構(gòu)建為穩(wěn)定細(xì)胞系、進(jìn)而限制該技術(shù)應(yīng)用場景的瓶頸問題。