展艷 周利斌 金文杰 杜艷 余麗霞 曲穎 馬永貴劉瑞媛

（1. 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810016；2. 中國科學(xué)院近代物理研究所生物物理室，蘭州 730030；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

輻射可以誘發(fā)豐富的植物表型及基因變異，且由于育種過程中突變率高、突變譜廣和育種周期相對較短［1]，被廣泛應(yīng)用于植物學(xué)研究、遺傳多樣性的拓展及種質(zhì)創(chuàng)新。輻射源、輻射材料與劑量的選擇都會直接或間接影響誘變效果。目前，利用輻射誘變技術(shù)培育了高產(chǎn)量、高抗性、矮化、葉色突變等指標(biāo)的新品種，成為植物育種的重要手段。葉色突變作為一種常見的突變性狀，可以作為標(biāo)記性狀來達(dá)到簡化良種繁育的目的，具有重要的研究價值。本文從輻射誘變育種、在輻射誘導(dǎo)下植物葉色突變的類型以及對葉色突變生理與分子機制的研究等方面進(jìn)行綜述。

1 輻射誘變概述

輻射誘變育種是指利用輻射方法，對生物樣本進(jìn)行輻照誘變，經(jīng)篩選、培養(yǎng)、穩(wěn)定后使其產(chǎn)生有利突變并穩(wěn)定遺傳而成為新品種的過程［2]。1928年，X射線和γ射線誘導(dǎo)大麥和玉米發(fā)生變異，揭開了植物輻射誘變育種研究工作的序幕［3-5]。我國輻射生物學(xué)始于20世紀(jì)50年代中后期，60年代輻射誘變才廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的育種工作［6]。目前，輻射誘變已應(yīng)用于多種植物遺傳改良工作，并取得重要的階段性成果。

輻射一般可分為非電離輻射和電離輻射，非電離輻射是指對被輻照物產(chǎn)生分子振動、轉(zhuǎn)動或者電子能級狀態(tài)改變而不引起物質(zhì)分子電離的輻射，如紫外線、激光、微波等本身能量較低，作用機理主要是電子激發(fā)后形成激發(fā)分子，導(dǎo)致DNA分子內(nèi)部化學(xué)鍵的斷裂。電離輻射是指能直接或間接引起物質(zhì)發(fā)生電離造成DNA損傷的輻射［7]，如射線、中子和重離子束等本身具有較高的能量。隨著核技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，輻射效應(yīng)的硬件設(shè)施和理論水平都有了顯著的提高，極大地促進(jìn)了輻射誘變技術(shù)的發(fā)展。目前，輻射誘變技術(shù)已日趨成熟，培育出高產(chǎn)量、高抗性、矮化、葉色突變等指標(biāo)的新品種，成為育種領(lǐng)域不可或缺的重要組成部分。

2 葉色突變的輻射誘導(dǎo)

2.1 主要的輻射誘變源

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要場所，對植物的生長具有重要意義。葉色變異是植物誘變育種的一種常見的突變性狀，雜交育種可以用葉色突變作為標(biāo)記性狀來簡化良種繁育［8]，達(dá)到去除假雜種、保證種子純度的目的，通過特殊優(yōu)良性狀的葉色變異為育種工作提供優(yōu)秀的種質(zhì)資源［9]。與其他突變方式相比，輻射誘變由于方法簡便、育種時間短、突變效率高且突變性狀豐富等特點應(yīng)用廣泛。目前，應(yīng)用于植物誘變育種的常用射線有X射線、γ射線、中子和離子束等，其中，重離子束是一種新的高能輻射源。X射線的輻射源是受激發(fā)的電子云，能量較高，直進(jìn)性、穿透性較強，能引起植物電離。閔可憐［10]用X射線、γ射線處理后的唐菖蒲在M3代的葉色變異性狀可以穩(wěn)定遺傳。γ射線的輻射源是放射性同位素，如137Cs、60Co，不帶電荷又無質(zhì)量，能量比X射線要高，具有很強穿透力。孫葉等［11]用60Coγ射線對春蘭‘雪山’的帶小芽植株輻照后出現(xiàn)斑縞、片縞、中斑、粉斑等葉色變異且性狀穩(wěn)定。中子的輻射源是核反應(yīng)堆中子源或中子發(fā)生器，穿透力很強，按能量大小分為快、中能、慢和熱中子。劉忠祥等［12]用快中子輻照玉米自交系后，M2、M3代出現(xiàn)葉色白化、黃化的突變體。離子束是質(zhì)量數(shù)≥4的帶電粒子低能注入、高能貫穿，具有能量動量轉(zhuǎn)移、電荷交換及質(zhì)量沉積三重效應(yīng)，相對生物學(xué)效應(yīng)高。崔濤［13]用中能碳離子束輻照百脈根干種子，對M2代植株群體進(jìn)行突變體篩選，最終得到了穩(wěn)定遺傳的葉片黃化變異植株C16。

2.2 輻射材料與劑量的選擇

輻射材料的選擇對誘變育種的成敗具有重要的作用，選擇遺傳背景明確、綜合性狀與適應(yīng)性好的材料有助于提高誘變效率。植物的各個部位都能用合適的輻照方法進(jìn)行誘變處理（圖1）。常用的材料有種子、花粉、植株或塊莖等營養(yǎng)器官，愈傷組織或原生質(zhì)體等離體培養(yǎng)材料［14]，不同的材料對輻射的敏感度也不同［15]，耿興敏等［16]研究表明輻射處理對不同品種桂花種子的萌發(fā)率存在顯著差異。種子含水量也會影響輻照效果，Kiani等［17]研究表明種子在不同含水量下，隨著伽馬輻照劑量的增加，幼苗成活率和幼苗長度均呈下降趨勢。育種目標(biāo)確定的前提下，應(yīng)根據(jù)所需輻照材料的特性及預(yù)期試驗?zāi)康淖鞒鲎罴堰x擇。

圖1 輻射處理植物的基本流程Fig. 1 Basic process of radiation treatment of plants

選擇適宜的輻照劑量同樣有利于誘變效果，在一定范圍內(nèi)，增加輻射劑量會提高突變率，但也會導(dǎo)致植物的生理損傷或死亡，相反，則會使突變體較少。因此，在對植物沒有嚴(yán)重?fù)p傷的前提下，要選擇得到較多突變體的輻射劑量。但是，由于輻照材料的遺傳差異和生長環(huán)境的不同會影響突變率，很難找到最佳輻射劑量，研究表示可以根據(jù)材料的半致死劑量（lethal dose 50%，LD50）來確定適宜的輻射劑量，Mohd等［18]研究一種常見草坪草的形態(tài)特征變化時設(shè)置了不同的γ射線輻照劑量，結(jié)果顯示，半致死劑量為90 Gy時的誘變率最高。李春盈等［19]認(rèn)為輻射后出苗率在40%左右可以作為輻射劑量可行的參考依據(jù)。

3 輻射誘導(dǎo)葉色突變的類型

葉色突變體通常在苗期便表現(xiàn)出與野生型不同的顏色，易于分辨，因此，苗期的葉色一般作為葉色突變體最常見的劃分標(biāo)準(zhǔn)。Awan等［20]依據(jù)葉片表型差異將葉色突變體細(xì)分為淺綠、條紋、斑點、黃化、白化、黃綠、綠白以及白翠等8種類型（圖2）。Sun等［21]運用60Co輻照，從水稻9311品種衍生了一種新的斑點葉突變體spl32，幼苗期從尖端到基部的葉子上覆蓋著壞死斑點，斑點從植物的底部到頂部出現(xiàn)。根據(jù)突變體對溫度和光照反應(yīng)的特性，劃分為溫度敏感型突變體［22]和光敏感型突變體［23]。Morita等［24]從碳離子輻照產(chǎn)生的水稻突變種群中獲得一種冷敏型突變體csv1，該突變體在30℃條件下于第五葉階段后發(fā)育出正常的綠葉，表明在生長和分蘗期早期對低溫有響應(yīng)。Zhou等［25]在60Co輻照下獲得光誘導(dǎo)黃葉突變體lyl1-1，LYL1編碼香葉基還原酶，影響水稻葉綠素的合成和光敏感性。研究者還依據(jù)植物葉色突變遺傳的方式，分為細(xì)胞核遺傳、細(xì)胞質(zhì)遺傳和核質(zhì)互作遺傳3種方式，一般多數(shù)屬于細(xì)胞核遺傳，Nakamura等［26]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子基因OsGLK1通過提高核編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育，并通過激活核編碼的sigma因子基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)光合作用機制的質(zhì)體編碼基因。Abe等［27]在輻射誘變下獲得的水稻白化突變體（CMD）受兩對隱性核基因的控制。根據(jù)突變體存活狀況還可分為致死突變、非致死突變及條件致死突變，苗期白化即為致死突變。到目前為止，葉色突變體主要是依據(jù)葉色表型與葉色突變機理來進(jìn)行系統(tǒng)分類的。

圖2 輻射誘變?nèi)~色突變的類型Fig. 2 Types of radiation-induced leaf color mutations

4 輻射誘導(dǎo)葉色突變機制

葉色突變機制比較復(fù)雜，植物生理和遺傳之間的互作導(dǎo)致植物葉色發(fā)生突變，并且不同的突變機制可能會引起相同的葉色變異。研究表明，輻射誘導(dǎo)下葉色突變的生理研究主要涉及光合色素含量、葉綠體結(jié)構(gòu)和光合特性。分子機制主要與葉綠素生物合成、葉綠素降解、葉綠體的分化發(fā)育等有關(guān)。

4.1 葉色突變生理機制

植物葉色突變體在葉綠素的合成或降解等途徑的直接或間接影響下，最終生理表現(xiàn)為光合色素種類、含量和比例的變化，葉綠素包括葉綠素a和葉綠素b，是參與光合作用的主要色素。葉綠體作為植物進(jìn)行光合作用的主要細(xì)胞器，葉色變異時葉綠體結(jié)構(gòu)和數(shù)目可能會產(chǎn)生不同程度的變化。而植物葉片的光合色素和葉綠體結(jié)構(gòu)對植物的光合能力和光合效率具有重要的作用。Gong等［28]在60Co γ射線下產(chǎn)生的水稻白化突變株asl1中，Chl a、Chl b和Car的含量都接近于零，白化表型是由總Chl含量降低引起的。在觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)葉綠體發(fā)育似乎在前體階段停止，突變體中未觀察到正常的葉綠體。Xia等［29]研究發(fā)現(xiàn)薔薇的葉片在經(jīng)60Co γ射線輻照后葉綠素含量顯著降低，且分析了葉綠素合成與代謝關(guān)鍵酶的基因表達(dá)后發(fā)現(xiàn)突變株葉綠素含量的降低可能是60Co γ射線抑制葉綠素合成和增強葉綠素降解的結(jié)果。輻射誘變產(chǎn)生的一種源自硬質(zhì)小麥的新型黃綠色突變體ygld的生理研究發(fā)現(xiàn)，突變體中色素含量（包括葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和總?cè)~綠素）降低。但chl a/chl b比值與野生型相比增加；透射電鏡分析表明葉綠體的形狀與結(jié)構(gòu)均有變化，形狀由橢圓形變?yōu)閳A形，且類囊體堆大小不一，在基質(zhì)區(qū)顯得雜亂無章；光合作用分析表明突變體的光合速率、熒光動力學(xué)參數(shù)均顯著降低，光合能力下降［30]。

4.2 葉色突變分子機制

4.2.1 葉綠素生物合成的變化 高等植物質(zhì)體中包括4類四吡咯化合物，即葉綠素、血紅素、西羅血紅素和光敏色素生色團(tuán)。它們的共同前體原卟啉IX與Mg2+螯合形成鎂原卟啉IX，最終形成葉綠素；與Fe2+螯合形成血紅色素，最終形成光敏色素生色團(tuán)［31-32]。葉綠素生物合成過程是四吡咯物代謝中的關(guān)鍵一環(huán)，葉綠素順利合成是從谷氨酰-tRNA開始，經(jīng)過多步的酶促生化反應(yīng)過程，最終形成葉綠素a和葉綠素b［33]。如圖3所示，在葉綠素合成過程中缺少任何一種酶都可能導(dǎo)致葉綠素合成受阻，造成葉綠素比例的失衡形成葉色突變體。YGL1、YGL2、YGL6、YGL7、YGL8、CHL1、CHL9等克隆的葉色突變基因都參加葉綠素合成的生物合成途徑［34-39]，形成黃綠葉色變異表型。其中，ygl2突變體出自60Co輻照的突變體庫，黃綠葉色表型在三葉期最明顯，抽穗期接近野生型的正常水平，序列分析表明，在YGL7的第一個外顯子1 kb插入，導(dǎo)致突變體YGL2表達(dá)顯著降低，光合作用相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化。金葉彎刺薔薇是通過γ射線輻照彎刺薔薇的種子后得到的金葉突變體，通過比較轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，葉綠素和類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)減弱，直接導(dǎo)致色素下降，同時，大多數(shù)DEGS還影響葉綠體的發(fā)育最終產(chǎn)生葉色變異［40]。60Co輻照群中篩選出的水稻ylc1突變體的葉片顏色自出苗至分蘗期表現(xiàn)為黃色，抽穗后葉片變?yōu)榫G色，實時熒光定量PCR表明，不同溫度影響突變體中與葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平［41]。葉綠素的生物合成和分解是一個動態(tài)平衡過程，打破平衡狀態(tài)就會產(chǎn)生葉色變異。

圖3 高等植物葉綠素生物合成途徑Fig. 3 Chlorophyll biosynthetic pathways in higher plants

4.2.2 葉綠素降解的變化 葉綠素降解是葉片衰老和果實成熟的最明顯跡象之一（圖4）［42-43]，主要分為兩個階段，首先葉綠素a（chlorophyll a, CHl a）在葉綠素酶（chrolophyllase, CS）和脫鎂螯合酶（Mg-dechelatase, MCS）的作用下分解成脫鎂葉綠酸a。然后在脫鎂葉綠酸a單加氧酶（pheide a oxygenase, PaO）和葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶（chlorophyll catabolite reducase, CCR）的催化下生成中間產(chǎn)物初級熒光葉綠素代謝物（primary fluorescent catabolite,pFCC）。第二個階段pFCC在液泡中形成非熒光葉綠素分解代謝產(chǎn)物（nonfluorescent chlorophyll catabolites, NCC），最終轉(zhuǎn)化為氧化降解產(chǎn)物。葉綠素降解過程中，基因發(fā)生突變會出現(xiàn)葉片滯綠現(xiàn)象，典型特征為葉綠素降解速率變慢，葉片較長時間內(nèi)維持綠色性狀。Jiang等［44]從水稻60Co輻射群中篩選出一株滯綠突變體，由SGR中A251-G251的單核苷酸替代導(dǎo)致水稻產(chǎn)生滯綠表型，過表達(dá)會減少葉片類囊體膜的數(shù)量，增加水稻衰老期間的葉綠素分解，可能是脫鎂葉綠酸a單加氧酶（PaO）途徑的上調(diào)基因，通過促進(jìn)PaO活性來加速葉綠素的降解。Yamatani等［45]從碳離子束輻射的水稻突變種群中篩選分離出葉綠素分解缺陷突變體nyc4-1，基因易位產(chǎn)生突變表型，NYC4參與葉片衰老過程中葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合物的降解。滯綠突變體由于獨特的表型可以延緩作物的葉片衰老從而提高作物產(chǎn)量，具有較高的研究價值。

圖4 葉綠素降解途徑Fig. 4 Chlorophyll degradation pathways

4.2.3 葉綠體的分化發(fā)育途徑變化 葉綠體是植物進(jìn)行光合作用主要場所，也是光合色素的主要載體。葉綠體的正常發(fā)育有助于植物葉綠素的代謝和積累，葉綠體的分化發(fā)育主要受到核-質(zhì)基因的共同調(diào)控，并且核糖體、葉綠體結(jié)構(gòu)蛋白、翻譯過程以及mRNA的剪接都會影響葉綠體。質(zhì)體核糖體蛋白（plastid ribosomal protein, PRP）是早期葉綠體發(fā)育的重要組成部分，研究鑒定出的一種熱敏葉綠素缺陷突變體tcd11的葉色白化，TCD11編碼葉綠體核糖體小亞基蛋白S6，其缺乏大大降低了葉綠體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并在低溫下阻止核糖體的組裝，對葉綠體發(fā)育具有重要的作用［46]。伴侶蛋白60（Cpn60）參與調(diào)節(jié)許多葉綠體蛋白多肽的折疊，其亞基OsCpn60β1突變體中，光合作用相關(guān)途徑和核糖體途徑受到顯著抑制從而影響葉綠體的發(fā)育［47]。Wang等［48]從60Co輻射突變池中得到的水稻溫敏白化突變體tcd5，葉片在低溫（20℃）下白化，高溫（32℃）下恢復(fù)正常，研究表明編碼單加氧酶的TCD5突變基因使其葉綠體的發(fā)育受損。對γ射線突變池中分離出的水稻熱敏性突變體的研究表明，水稻中核編碼的TSV3在冷脅迫下影響葉早期葉綠體的發(fā)育［49]。水稻條紋葉色突變體st2（stripe2）表現(xiàn)出葉綠素積累減少和葉綠體異常，分析表明ST2編碼一種dCMP脫氨酶，該酶可作為葉綠體發(fā)育的新型調(diào)節(jié)因子［50]。Zhou等［51]發(fā)現(xiàn)了60Co輻照下的一種水稻溫敏條紋葉色突變體yss1，研究表明YSS8基因中第一個內(nèi)含子的異常剪切導(dǎo)致YSS1表達(dá)降低，第8個內(nèi)含子保留導(dǎo)致YSS1表達(dá)積累。YSS1是水稻幼苗期葉綠體發(fā)育必需的質(zhì)體RNA聚合酶（plastidencoded plastid, PEP）活性的重要調(diào)節(jié)因子。

4.2.4 其他途徑產(chǎn)生的葉色突變 已報道的研究表明，除了常見的葉色突變機制外，植物的一些其他代謝方式、基因突變、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也能夠引發(fā)葉色突變。植物中的線粒體終止轉(zhuǎn)錄因子通過多種機制參與葉綠體和線粒體基因的表達(dá)，編碼這類家族蛋白的基因發(fā)生突變，同樣會影響植物葉綠體的發(fā)育過程以及葉綠素的合成［52]。γ射線誘變后的突變池中得到的斑點葉突變體spl3，發(fā)現(xiàn)其對脫落酸（ABA）不敏感，在含ABA的培養(yǎng)基中根系正常，并且黑暗誘導(dǎo)和自然衰老期間可以延遲葉片黃化，分析表明SPL3可以正向調(diào)節(jié)ABA響應(yīng)信號通路，在重要的植物激素信號傳導(dǎo)相關(guān)過程，如非生物脅迫信號傳導(dǎo)、葉片衰老及對病原體的防御之間的互作有重要的作用［53]。Wang等［54]在γ射線突變池中鑒定出的大麥熱誘導(dǎo)葉綠素缺陷突變體V-V-Y，遺傳分析表明突變性狀受單個核基因控制。Li等［55]在60Co輻照水稻突變?nèi)褐蟹蛛x出ylc2突變體，幼苗期呈萎黃表型，研究表明定位到的突變基因OsYLC2編碼血紅素加氧酶2（OsHO2）蛋白，OsHO2可以通過與葉綠體內(nèi)的四吡咯代謝物和（或）酶相互作用來調(diào)節(jié)四吡咯生物合成來影響葉綠素的生物積累。

5 總結(jié)與展望

植物葉色突變的性狀直觀明顯、便于觀察鑒別，并且是與光合作用直接相關(guān)的，對植物生理學(xué)研究、葉綠素的代謝途徑、葉綠體的發(fā)育與功能、功能基因組學(xué)研究及蛋白質(zhì)組學(xué)等研究都是良好的種質(zhì)資源。葉色突變體也可以作為標(biāo)記性狀提高雜交制種純度，縮短育種年限，促進(jìn)育種進(jìn)程和提高種質(zhì)資源利用效率。除此以外，葉色突變體也被直接用于觀賞植物新品種的培育［56]，為景觀構(gòu)建提供豐富的材料。輻射誘變由于突變率高、突變譜廣、方向多樣性、誘發(fā)的突變穩(wěn)定、周期相對較短等優(yōu)點被廣泛用于作物改良育種。輻射誘變源、輻射材料與劑量的選擇會直接或間接影響突變效果，根據(jù)試驗的目的選擇適宜的方案是獲得突變體的關(guān)鍵。目前，對主要農(nóng)作物的輻射誘發(fā)葉色突變研究較多，而對觀賞植物、果蔬等的葉色突變的研究相對較少，相信隨著輻射誘變技術(shù)的不斷發(fā)展，對植物葉色突變機制的研究會越來越深入，葉色突變體的應(yīng)用亦將越來越廣泛。