葉云芳 田清尹 施婷婷 王亮 岳遠(yuǎn)征 楊秀蓮 王良桂

（1. 南京林業(yè)大學(xué)，南京 210037；2. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)業(yè)中心，南京 210037；3. 大千生態(tài)環(huán)境集團(tuán)股份有限公司，南京 210036）

植物的葉、花、果實、種仁等結(jié)構(gòu)會釋放出各種各樣的揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds, VOCs）［1-2]。VOCs是親脂性液體，通常分為苯丙烷類、脂肪酸、氨基酸和萜類化合物［3]，β-紫羅蘭酮（β-ionone, BI）是植物產(chǎn)生的一種VOCs，屬于萜類化合物?！白狭_蘭酮”的名字來源于“iona”（希臘語為紫羅蘭色）和“酮”，前者指紫羅蘭的氣味，后者指紫羅蘭酮的結(jié)構(gòu)，β-紫羅蘭酮作為一類環(huán)化異戊二烯，廣泛用于化工合成視黃酸、視黃醇、β-胡蘿卜素和維生素A等化合物［4-7]。由于β-紫羅蘭酮具有極低的氣味閾值和宜人的氣味，被廣泛應(yīng)用于化妝品和香水行業(yè)［8]。此外，β-紫羅蘭酮具有抗癌、抗菌抗炎、抗微生物和降血脂等有益人體健康的功效［9-14]。作為植物重要的香氣物質(zhì)之一，β-紫羅蘭酮廣泛分布于許多植物中，如桂花（Osmanthus fragrans）、矮牽牛（Petunia hybrida）、波邦薔薇（Rosa bourboniana）、歐洲酸櫻桃（Prunus cerasus）、無花果（Ficus carica）等［5,15-21]。綜上所述，β-紫羅蘭酮作為一類異戊二烯，在提高植物觀賞性能、促進(jìn)人體健康以及生產(chǎn)應(yīng)用等方面具有重要作用，因此植物β-紫羅蘭酮的生物合成與代謝調(diào)控研究逐漸成為熱點。本文結(jié)合β-紫羅蘭酮的理化性質(zhì)、生物活性，綜述β-紫羅蘭酮生物合成調(diào)控途徑、途徑中相關(guān)基因?qū)χ参锘?、果、葉的影響和基因工程技術(shù)對植物中β-紫羅蘭酮進(jìn)行改良的研究進(jìn)展，同時對該領(lǐng)域研究作了合理展望，以期為人工調(diào)節(jié)植物中β-紫羅蘭酮的含量，提高植物的觀賞性狀及獲得高產(chǎn)量的天然β-紫羅蘭酮提供參考。

1 β-紫羅蘭酮的基本性質(zhì)

1.1 植物中的β-紫羅蘭酮

作為一種常見的天然VOC，β-紫羅蘭酮主要存在于一些香味濃郁的植物中，如覆盆子（Rubus idaeus）、甜櫻桃（Prunus avium）、葡萄（Vitis vinifera）等果實，或茶葉（Camellia sinensis）、桂花、杜松（Juniperus rigida）、粗糙霧冰藜（Bassia muricata）等植物的花、葉中［22-30]。不同植物中β-紫羅蘭酮相對含量的差別很大，例如在變?nèi)~木（Codiaeum variegatum）中有相對含量高達(dá)29.7%的環(huán)氧β-紫羅蘭酮［31]；樹莓（Rubus corchorifolius）中檢測出β-紫羅蘭酮相對含量為10.46%［32]；而β-紫羅蘭酮在中國黃茶中的相對含量則極低，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有1.10 μg/kg［33]。β-紫羅蘭酮在同種植物不同品種中的相對含量也不一樣，在浙江省栽培的29個桂花品種中，檢測出β-紫羅蘭酮相對含量最低和最高的品種間有超過10倍的差距，其范圍為4.75%-50.90%［25]。通過分析不同顏色（橙色、紫色、白色和黃色）的胡蘿卜（Daucus carota）品種根部的VOCs組成發(fā)現(xiàn)，只有橙色和紫色品種的根部會積累大量β-紫羅蘭酮，白色和黃色品種的根部則無積累［21]。

1.2 β-紫羅蘭酮的理化性質(zhì)及其衍生物

紫羅蘭酮是一種由13個碳組成的酮類化合物，具有一個單環(huán)萜類骨架，自然界中存在多種異構(gòu)紫羅蘭酮，包括α-紫羅蘭酮、γ-紫羅蘭酮等，它們的區(qū)別在于雙鍵的位置不同［8,34]。β-紫羅蘭酮（C13H20O）全稱4-（2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯基）-3-丁烯-2-酮，分子量為192.30［6]。其顏色為淡黃色或黃色，常溫下以液體形式存在，不溶于水和甘油，可溶于大多數(shù)油和醇類物質(zhì)，具有紫羅蘭（Matthiola incana）花香香味［35]。β-紫羅蘭酮已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)為安全類物質(zhì)（generally recognized as safe,GRAS），廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中［12]。目前有多種已被鑒定的β-紫羅蘭酮衍生物，如二氫-β-紫羅蘭酮、甲基-β-紫羅蘭酮、6-甲基-β-紫羅蘭酮、異甲基-β-紫羅蘭酮等，和β-紫羅蘭酮一樣，都具有木香、花香、果香香氣，可用作食品添加劑、化妝品和香水的組成部分［8,36-39]。此外，還可以通過一定的技術(shù)手段將β-紫羅蘭酮轉(zhuǎn)化為β-紫羅蘭酮的衍生物，例如β-紫羅蘭酮通過使用昂貴的催化劑，如手性銠或膦釕的不對稱加氫這一化學(xué)生產(chǎn)過程可以合成二氫-β-紫羅蘭酮［40-41]。生物技術(shù)生產(chǎn)方面，來自青蒿（Artemisia annua）的青蒿醛雙鍵還原酶（double bond reductase,DBR）可以實現(xiàn)將β-紫羅蘭酮轉(zhuǎn)化為二氫-β-紫羅蘭酮［42]。但在生物體內(nèi)，β-紫羅蘭酮和其衍生物的相互轉(zhuǎn)化的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討（表1）。

表1 α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮及其衍生物的概況Table 1 General information of α-ionone, β-ionone and their derivatives

1.3 β-紫羅蘭酮的生物活性

β-紫羅蘭酮在生物體內(nèi)外均表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗癌活性［47]。β-紫羅蘭酮可抑制細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCoA）還原酶，從而在肝癌發(fā)生過程中顯示出良好的預(yù)防作用［48]。β-紫羅蘭酮具有通過自由基清除特性的抗增殖和抗氧化潛力，可以有效改善肺部癌變［49]；β-紫羅蘭酮還可以抑制大鼠由7,12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethylbenz［a]anthracene, DMBA）引發(fā)的乳腺癌［47]。此外，β-紫羅蘭酮具有很好的抗菌效果，例如龍膽（Adenophora capillaris）、鉆果大蒜芥（Sisymbrium officinale）等提取精油后，采用圓盤擴(kuò)散法或最小抑菌濃度程序評價β-紫羅蘭酮的抗菌活性，結(jié)果表明，所有精油均表現(xiàn)出潛力巨大的抗菌活性［50-53]。驅(qū)避或引誘昆蟲研究表明，β-紫羅蘭酮對跳蚤甲蟲（Phyllotreta cruciferae）和蜘蛛螨（Tetranychus urticae）都有很強(qiáng)的驅(qū)蟲作用［54]；研究推測當(dāng)β-紫羅蘭酮釋放出足夠的量，可以阻止食草昆蟲侵害在露天栽種的作物［55]。β-紫羅蘭酮也可用作誘餌來吸引昆蟲，在巴西巴拉那州伊瓜蘇國家公園的混合親水森林或這一地貌與山地半落葉森林之間的過渡區(qū)，用β-紫羅蘭酮作為氣味誘捕器的誘餌，可以持續(xù)捕獲雄性下頜真舌蝴蝶（Euglossa mandibularis）［56]。通過使用其作為信息素來吸引昆蟲，可減少農(nóng)藥使用，從而實現(xiàn)環(huán)保型生產(chǎn)。

2 β-紫羅蘭酮合成途徑及其調(diào)控機(jī)制

2.1 植物中β-紫羅蘭酮的合成代謝及其相關(guān)酶

現(xiàn)有研究表明，β-紫羅蘭酮存在于含有類胡蘿卜素（carotenoid）的植物中，從合成途徑上看，β-紫羅蘭酮主要是由類胡蘿卜素裂解產(chǎn)生的一種脫輔基類胡蘿卜素（apocarotenoids）［43]。目前合成香氣物質(zhì)β-紫羅蘭酮的基本途徑和結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)得到鑒定和克隆，然而關(guān)于其形成的調(diào)控機(jī)理仍鮮有報道。

脫輔基類胡蘿卜素和類胡蘿卜素作為異戊二烯的一個亞類，其生物合成主要來源于番茄紅素，番茄紅素起始于2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（mevalonate pathway, MEP）途徑合成的異戊烯基焦磷酸鹽（isopentenyl diphosphate, IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸鹽（dimethyl allyl pyrophosphate,DMAPP）［57]。番茄紅素經(jīng)由番茄紅素ε-環(huán)化酶（lycopene-?-cyclase, LCYE）和番茄紅素β-環(huán)化酶（lycopene-β-cyclase, LCYB）催化轉(zhuǎn)化為δ-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素［58]。然后α-胡蘿卜素通過ε-環(huán)胡蘿卜素羥化酶（carotene-?-hydroxylase, CHYE）和β-環(huán)胡蘿卜素羥化酶（carotene-β-hydroxylase, CHYB）催化的過程轉(zhuǎn)化為葉黃素。而β-胡蘿卜素的降解一分為二：一方面通過β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase,BCH）和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化物酶（zeaxanthin epoxidase,ZEP）催化的過程轉(zhuǎn)化為環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)，最后通過新黃質(zhì)合成酶（neoxanthin synthase, NXS）合成新黃質(zhì)；另一方面通過類胡蘿卜素裂解氧化酶（carotenoid cleavage oxidases, CCOs）裂解成脫輔基類胡蘿卜素（圖1）［59]。CCOs可以分解類胡蘿卜素的多烯鏈特異性雙鍵，其包括類胡蘿卜素切割雙加氧酶（arotenoid cleavage dioxygenases, CCDs）和九順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenas, NCEDs）［60-63]。將來自高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）等12個物種的90個CCO基因分為6組（即CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、NCED和CCD-like），其中來自高粱、玉米和水稻的一些CCD8基因與其他9個物種的CCD8基因沒有分為一組，而是聚集在CCDlike組中［62]。已有研究表明，CCD7和CCD8與形成獨腳金內(nèi)脂有關(guān)，而形成與β-紫羅蘭酮香氣成分相關(guān)的CCD主要是CCD1、CCD4、CCD10［64-65]。它們具有不同的特異性和切割位點，以不同的類胡蘿卜素作為底物，從而有助于植物中脫輔基類胡蘿卜素香氣成分多樣性地形成［57,64,66-68]。而關(guān)于β-紫羅蘭酮在植物體內(nèi)的降解途徑鮮有報道，目前僅在青蒿和桂花中有所研究，β-紫羅蘭酮可由DBR1、DBR2在植物體外生物轉(zhuǎn)化成二氫-β-紫羅蘭酮［42]。筆者團(tuán)隊根據(jù)桂花中已有功能報道的類DBR氨基酸序列，在日香桂基因組中同源比對，得到與其同源性高達(dá)99%的序列（evm.model.Contig48.8），即12-氧代植物二烯酸還原酶（12-oxo-phytodienoic acid reductase, OPR），但其功能是否與DBR一致，還需進(jìn)一步實驗研究（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

圖1 植物中β-紫羅蘭酮的生物合成途徑Fig. 1 Biosynthetic pathways of β-ionone in plants

2.2 β-紫羅蘭酮合成途徑的基因調(diào)控

合成β-紫羅蘭酮的前體物質(zhì)是類胡蘿卜素，由其合成途徑可知主要由CCD酶基因參與類胡蘿卜素裂解（圖2-A）。研究表明在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtCCD1可以催化線性和環(huán)狀類胡蘿卜素9，10（9'，10'）位置的裂解，基于類胡蘿卜素底物的不同性質(zhì)產(chǎn)生1-2個紫羅蘭酮分子或不同的氧化衍生物［60]。此外，CCD1還可以在5，6（5'，6'）和7，8（7'，8'）位置切割番茄紅素雙鍵［69-70]。目前，已在桂花和茶葉等多種植物中鑒定出CCD1的同源基因，可催化類胡蘿卜素裂解產(chǎn)生β-紫羅蘭酮，且研究表明CCD1的啟動子和編碼序列多樣性有助于β-紫羅蘭酮的差異積累［43,71]。CCD4在擬南芥、大馬士革玫瑰（Rosa damascena）、菊花（Chrysanthemum morifolium）和蘋果（Malus domestica）、葡萄中切割β-胡蘿卜素以產(chǎn)生β-紫羅蘭酮［72-73]?，F(xiàn)有研究驗證了一種來自煙草的新型類胡蘿卜素切割雙加氧酶NtCCD10的功能，NtCCD10和CCD1在結(jié)構(gòu)上存在一些差異，NtCCD10可以在9，10（9'，10'）位置對稱地裂解八氫番茄紅素和β-胡蘿卜素，產(chǎn)生香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮［65]。

圖2 植物中β-紫羅蘭酮的合成調(diào)控圖Fig. 2 Regulation map of β-ionone synthesis in plants

除結(jié)構(gòu)基因參與β-紫羅蘭酮生物合成外，還有轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控β-紫羅蘭酮合成。植物中的主要轉(zhuǎn)錄因子家族包括WRKY、MYB、NAC、MADS等，它們參與眾多生命活動，如應(yīng)激反應(yīng)、新陳代謝和激素誘導(dǎo)等。然而，目前對調(diào)節(jié)CCD表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子知之甚少。有研究表明，在‘棗黃’和‘橙紅’丹桂兩個桂花品種中β-紫羅蘭酮含量差異主要受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控影響［74]。桂花OfWRKY3可以與OfCCD4啟動子中存在的W-box回文基序結(jié)合，是OfCCD4基因的正調(diào)節(jié)因子［75]。同時OfWRKY1和OfERF61也被證明上調(diào)桂花OfCCD4基因的表達(dá)，影響β-紫羅蘭酮合成，使花香改變［76]。而桃（Prunus persica）的PpNAC19和葡萄的VvMADS4可抑制各自體內(nèi)CCD4的啟動子活性，負(fù)調(diào)控β-紫羅蘭酮合成［73,77]。部分轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)β-類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化也能影響到β-紫羅蘭酮，比如柑橘（Citrus reticulata）中的CrMYB68可以負(fù)調(diào)控CrBCH2和CrNCED5兩個基因表達(dá)，從而控制類胡蘿卜素α-分支和β-分支的轉(zhuǎn)化，最終影響β-紫羅蘭酮的合成，同屬于柑橘屬的甜橙（Citrus sinensis）的轉(zhuǎn)錄因子CsMADS6、CsERF061通過直接結(jié)合CCD1啟動子來上調(diào)其的表達(dá)［78-80]。除此之外，轉(zhuǎn)錄因子還可以通過影響相關(guān)信號傳導(dǎo)蛋白的活性從而控制β-紫羅蘭酮合成，如番茄（Solanum lycopersicum）中的SlPRE2通過影響參與光信號傳導(dǎo)的bHLH（basic helix-loop-helix）蛋白的活性來控制類胡蘿卜素裂解合成β-紫羅蘭酮（圖2-A）［81]。

2.3 β-紫羅蘭酮合成途徑的環(huán)境因子調(diào)控

β-紫羅蘭酮除了由β-胡蘿卜素通過CCD1、CCD4、CCD10酶促反應(yīng)裂解產(chǎn)生，也受環(huán)境因素的調(diào)控。研究表明，β-紫羅蘭酮可以由光氧化和熱氧化降解合成［82]。對棉花（Gossypium hirsutum）的GhCCDs中啟動子區(qū)域的順式作用元件分析表明，大多數(shù)元件與光、冷、熱、鹽和干旱等非生物脅迫的響應(yīng)有關(guān)，這表明β-紫羅蘭酮合成途徑關(guān)鍵酶基因受環(huán)境因子調(diào)控［83]。藍(lán)藻（cyanobacteria）在高光誘導(dǎo)下上調(diào)NosCCD基因表達(dá)，促進(jìn)β-紫羅蘭酮的合成［84]。紫外線B（ultraviolet B, UV-B）輻射通過控制桃中的PpCCD4的轉(zhuǎn)錄水平，從而介導(dǎo)β-紫羅蘭酮的合成，此外，用乙烯熏蒸處理過的桃中β-紫羅蘭酮的含量顯著增加［85]。在茶葉枯萎的過程中β-紫羅蘭酮會逐漸積累，有兩種酶的含量變化可以驗證該現(xiàn)象，分別為CsCCD4和CsCCD1a，其中CsCCD4含量變化是由機(jī)械損傷和低溫引起的，CsCCD1a的含量變化由脫水應(yīng)激誘導(dǎo)［86]。另外，高鹽脅迫會導(dǎo)致杜氏菌中包括β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮和β-環(huán)檸檬醛在內(nèi)的類胡蘿卜素裂解產(chǎn)物大量積累［87]。因此，包括β-紫羅蘭酮在內(nèi)的多種類胡蘿卜素氧化產(chǎn)物可以作為植物中的脅迫信號（圖2-B）［88]。

3 β-紫羅蘭酮合成相關(guān)基因?qū)χ参锶~片、花朵、果實的影響

β-紫羅蘭酮合成的過程也是類胡蘿卜素降解的過程，因此其相關(guān)基因?qū)χ参锏娜~片、花朵、果實主要有色澤和香氣兩部分的影響。

3.1 β-紫羅蘭酮合成相關(guān)基因?qū)θ~片的影響

類胡蘿卜素在植物葉片中含量豐富，在葉綠素降解后由其控制葉片色彩，因此類胡蘿卜素降解合成β-紫羅蘭酮的過程中，葉片的顏色和氣味都會發(fā)生變化［89-90]。天然香料七葉蘭（Pandanus amaryllifolius）中的β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮和β-環(huán)檸檬醛等香氣化合物，都是在CCD基因的調(diào)控下發(fā)生酶促反應(yīng)生成［85,91]。CsCCD1和CsCCD4參與裂解茶葉中的β-胡蘿卜素，生成茶葉中的主要香料之一的β-紫羅蘭酮，使茶葉更具香韻［71,86]。NtCCD1c可以特異性地裂解β-胡蘿卜素和番茄紅素，分別產(chǎn)生β-紫羅蘭酮和假紫羅蘭酮，同時NtCCD1是類胡蘿卜素含量的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在煙草葉片中活性氧含量的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用［92]。

3.2 β-紫羅蘭酮合成相關(guān)基因?qū)ǘ涞挠绊?/h3>

花香是植物最重要的特征之一，可以吸引和引導(dǎo)傳粉者完成授粉，這對被子植物的受精至關(guān)重要［3]。現(xiàn)有研究已經(jīng)確認(rèn)，β-紫羅蘭酮是一種重要花香物質(zhì)，在墨蘭（Cymbidium sinense）的6個品種中測得的50種化合物中，β-紫羅蘭酮總體占比最高，為0.37%-20.23%，而CCD1和CCD4是調(diào)節(jié)花朵中β-紫羅蘭酮形成的重要基因［60,75,93]。CCD1基因在大馬士革玫瑰、桂花中被證實負(fù)責(zé)C13-正異戊二烯（如β-紫羅蘭酮、β-大馬士革酮和α-紫羅蘭酮）的積累，以及在體外試驗中可以裂解多種類胡蘿卜素［94]。OfCCD4可以調(diào)控桂花花瓣中類胡蘿卜素的裂解，從而控制花瓣顏色的深淺，同時影響β-紫羅蘭酮、二氫-β-紫羅蘭酮等花香物質(zhì)的積累［74]。CmCCD4a可以抑制類胡蘿卜素的積累從而使菊花呈現(xiàn)白色，其表達(dá)嚴(yán)格限于花瓣，在其他器官（如根、莖或葉）中未檢測到［95]。

3.3 β-紫羅蘭酮合成相關(guān)基因?qū)麑嵉挠绊?/h3>

β-紫羅蘭酮是水果中重要的香氣化合物，迄今為止，在番茄、桃、李子（Prunus salicina）、草莓（Fragaria×ananassa）、枸杞（Lycium chinense）、甜橙（Citrus sinensis）和葡萄中廣泛研究［96-105]。研究表明桃的果實成熟過程中，β-紫羅蘭酮的合成在很大程度上是由酶促作用主導(dǎo)的，PpCCD1和PpNCED1的轉(zhuǎn)錄水平下降會導(dǎo)致類胡蘿卜素積累增加，且PpCCD4也被證實可以決定桃子的果肉顏色［106-108]。在番茄果實中SlNCED的較低表達(dá)會導(dǎo)致類胡蘿卜素積累增加，從而顯示出深紅色［109]。抑制柑橘CCD1基因的表達(dá)后，其外觀色澤輕微變黃，同時紫黃質(zhì)和9-順式-紫黃質(zhì)含量顯著上升［110]。隨著消費(fèi)市場對水果品質(zhì)要求的不斷提升，作為果實的一種特色風(fēng)味，怡人的香氣是果品吸引消費(fèi)者和增強(qiáng)市場競爭力的重要因素之一，通過基因工程技術(shù)改良果香將極大提高果實的經(jīng)濟(jì)價值［111-112]。

4 基因工程技術(shù)在改良植物中β-紫羅蘭酮的應(yīng)用

作為β-胡蘿卜素的代謝產(chǎn)物，β-紫羅蘭酮的合成和積累依賴于合成途徑中關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，因此對天然β-紫羅蘭酮進(jìn)行改良的最有效的基因工程技術(shù)手段，是關(guān)鍵酶基因的過表達(dá)或沉默以及異源表達(dá)。

4.1 關(guān)鍵酶基因的過表達(dá)或沉默

八氫番茄紅素合酶（phytoene synthase, PSY）基因、八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase,PDS）基因、ζ-胡蘿卜素去飽和酶（ζ-carotene desaturase, ZDS）基因、番茄紅素β-環(huán)化酶（lycopene-β-cyclase, LCYB）基因和紫黃質(zhì)去環(huán)氧化酶（violaxanthin de-epoxidase, VDE）基因等都不是調(diào)節(jié)β-紫羅蘭酮合成的關(guān)鍵酶基因，其合成的關(guān)鍵酶基因為ZEP、NCED1、CCD1和CCD4［74]。在植物體內(nèi)可以利用過表達(dá)關(guān)鍵酶基因或基因敲除、RNA干擾（RNA interference, RNAi）等手段沉默酶基因，從而改良植物中β-紫羅蘭酮的合成?！爰t’木瓜（Carica papaya cv. ‘Sui hong’）中CpCCD1的過表達(dá)可能刺激β-胡蘿卜素和番茄紅素的降解，進(jìn)而形成6-甲基-5-庚烯-2-酮和β-紫羅蘭酮等特異性揮發(fā)物［113]。OfCCD4在桂花中的高基因表達(dá)，促進(jìn)類胡蘿卜素在花瓣中裂解，使花色變淺（淺黃色），β-紫羅蘭酮含量升高，改變桂花花香和花色［74]。敲除歐洲油菜（Brassica napus）花瓣中BnaC09.ZEP和BnaA09.ZEP，可以引起其β-胡蘿卜素含量改變，影響β-紫羅蘭酮合成［114]。在番茄（Lycopersicon esculentum）果實中，沉默LeCCD1A和LeCCD1B可導(dǎo)致成熟果實中β-紫羅蘭酮的含量顯著降低［15]。在牽牛花AK77栽培種（Ipomoea nil cv. AK77）以及菊花（Chrysanthemum morifolium）中，利用RNAi技術(shù)或CRISPR/Cas9的基因敲除技術(shù)沉默CCD4基因，都可以使花瓣從白色變成淡黃色，說明類胡蘿卜素裂解效率變低，從而導(dǎo)致β-紫羅蘭酮含量下降［95,115]。利用RNAi技術(shù)，降低靶基因SlNCED8的表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因果實的SlNCED1轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，共同作用導(dǎo)致類胡蘿卜素積累，β-紫羅蘭酮含量下降［109]。

4.2 關(guān)鍵酶基因的異源表達(dá)

β-紫羅蘭酮的異源合成依賴于其前體β-胡蘿卜素的降解，利用源于植物的CCDs在大腸桿菌（Escherichia coli）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）中已經(jīng)成功地進(jìn)行了β-紫羅蘭酮的異源合成［20,70]。當(dāng)在工程大腸桿菌（生產(chǎn)八氫番茄紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)）和酵母菌（生產(chǎn)β-胡蘿卜素）中異源表達(dá)NtCCD10時，NtCCD10可以對稱切割八氫番茄紅素和β-胡蘿卜素分別產(chǎn)生香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮［65]。向大腸桿菌中轉(zhuǎn)入了CsCCD1基因和OfCCD4基因，可以產(chǎn)生β-紫羅蘭酮［116]。迄今為止，使用大腸桿菌菌株獲得的β-紫羅蘭酮最高滴度為32.4 mg/L［57]。由于酵母細(xì)胞工廠具有公認(rèn)的GRAS標(biāo)簽，因此是合成應(yīng)用于食品行業(yè)的β-紫羅蘭酮的首選平臺［117]。在最早的研究中，CCD1在酵母菌中異源表達(dá)，β-紫羅蘭酮的滴度僅為5 mg/L［118-119]。經(jīng)過改造解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株后，通過異源表達(dá)可以產(chǎn)生68 mg/L滴度的β-紫羅蘭酮［120]。有研究測試了來自不同植物的各種CCD酶在異源宿主中β-紫羅蘭酮合成的區(qū)別，比較了擬南芥、葡萄、矮牽牛和桂花的CCD1基因在大腸桿菌中的異源表達(dá)，其中效率最高的是PhCCD1［57]。在工程酵母菌株SCIGS22中轉(zhuǎn)入矮牽牛的PhCCD1，可以產(chǎn)生（0.073 ± 0.01）mg/g干重的β-紫羅蘭酮，將紅發(fā)夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）的crtYB、crtI基因和PhCCD1異源轉(zhuǎn)入SCIGS22共同表達(dá)導(dǎo)致β-紫羅蘭酮濃度增加8.5倍［（0.63 ± 0.02）mg/g干重]，使用該菌株進(jìn)行批量發(fā)酵，在1 h后最終為50 mg/g干重，增加了15倍［119]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，將PhCCD1轉(zhuǎn)入酵母菌中異源表達(dá)，生成了184 mg/L滴度和高達(dá)32 mg/g干重的β-紫羅蘭酮，這是迄今為止CCD1在酵母菌中異源表達(dá)的最高水平［121]。盡管在微生物細(xì)胞工廠中過量生產(chǎn)β-紫羅蘭酮的代謝工程策略已經(jīng)相當(dāng)成功，但仍需要提高生產(chǎn)效率以使該技術(shù)具有競爭力（表2）。

表2 基因工程技術(shù)改良植物中β-紫羅蘭酮的應(yīng)用Table 2 Application of β-ionone in plants improvement by genetic engineering technology

5 展望

β-紫羅蘭酮是一種重要香氣物質(zhì)，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果等器官中，是植物中具有多種生物活性的類胡蘿卜素代謝產(chǎn)物，在提高植物觀賞商用價值、促進(jìn)人體健康以及生產(chǎn)應(yīng)用等方面具有重要作用。植物中β-紫羅蘭酮的釋放與類胡蘿卜素生物合成和降解基因的表達(dá)量高低有明顯的相關(guān)關(guān)系，但有關(guān)β-紫羅蘭酮合成和降解的分子調(diào)控機(jī)制卻少有報道，近年來隨著染色質(zhì)可及性測序（assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq）等高通量測序技術(shù)和以CRISPR/Cas9為代表的基因組編輯技術(shù)的不斷改進(jìn)發(fā)展，以及在不同植物中的廣泛應(yīng)用，利用現(xiàn)代生物學(xué)手段發(fā)現(xiàn)并鑒定植物中β-紫羅蘭酮生物合成的特異性調(diào)控因子及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將變成可能［122-123]。許多關(guān)于植物香氣物質(zhì)的研究是在模式植物或微生物上進(jìn)行的，常用頂空固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜法（headspace solid-phase microextraction gas-chromatographic mass-spectrometric method, HSSPME-GC/MS）對揮發(fā)性類胡蘿卜素裂解產(chǎn)物進(jìn)行檢測和定量，對該方法進(jìn)行了優(yōu)化，已在擬南芥體外、體內(nèi)進(jìn)行了驗證［124]。優(yōu)化后的測量方法有利于在植物中找到更多的香氣物質(zhì)，開發(fā)了基于大腸桿菌的模塊化途徑優(yōu)化和酶工程的策略，用以大量生產(chǎn)天然的β-紫羅蘭酮，顯示出了利用微生物或植物生產(chǎn)天然β-紫羅蘭酮的巨大潛力［57,125]。

人們對于植物β-紫羅蘭酮的認(rèn)識日新月異，但目前植物中β-紫羅蘭酮的研究仍缺乏系統(tǒng)性，以下幾個方面還需要進(jìn)一步探索和完善：（1）β-紫羅蘭酮合成的更多調(diào)控機(jī)制，包括酶基因調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等；（2）提升β-紫羅蘭酮的分離純化技術(shù)；（3）β-紫羅蘭酮對植物、動物和人類的其他未探明生物活性；（4）植物生長過程中β-紫羅蘭酮的動態(tài)變化；（5）果實或花器官中β-紫羅蘭酮香氣濃度與類胡蘿卜素含量的關(guān)系；（6）開發(fā)β-紫羅蘭酮的新產(chǎn)品；（7）生產(chǎn)具有較高β-紫羅蘭酮香氣的水果和花卉；（8）通過轉(zhuǎn)基因工程生產(chǎn)天然的β-紫羅蘭酮香精香料。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及研究的日漸深入，對β-紫羅蘭酮的合成調(diào)控的認(rèn)識也會更加深刻，從而更好地改良和利用植物中的β-紫羅蘭酮資源。