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        乳酸菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg3工藝研究

        2023-09-01 01:38:40嚴(yán)建剛陸路付少委方磊王雨晴張新雪
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2023年16期
        關(guān)鍵詞:干酪糖苷酶蔗糖

        嚴(yán)建剛,陸路,付少委,方磊,王雨晴,張新雪*

        1(完美(廣東)日用品有限公司,廣東 中山,528400) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京,100015)

        人參(PanaxginsengC.A.Meyer)為五加科多年生草本植物人參的根,是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥,主要產(chǎn)于東北三省、河北、河南、湖北、云南等省份[1]。人參皂苷(Ginsenoside,GS)是人參皂苷元與糖基相連形成的三萜類化合物,主要分為原人參二醇型皂苷、原人參三醇型皂苷、齊墩果酸型人參皂苷[2]。作為人參生理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ),人參皂苷具有多種生理功能,尤其是稀有人參皂苷(rare ginsenosides)具有極高的藥用價(jià)值[3]。研究發(fā)現(xiàn),稀有人參皂苷CK具有抗老化、護(hù)肝、抗炎、抗血栓等作用[4-5];稀有皂苷 Rh1具有增強(qiáng)記憶力、腦皮層神經(jīng)細(xì)胞缺氧保護(hù)、抗過敏、降血糖等作用[6-8];稀有皂苷Rg3的分子式為C42H72O13,研究發(fā)現(xiàn)Rg3對肺癌實(shí)體瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性作用,可以通過抑制肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移起到抗腫瘤的作用[9],Rg3還在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、抗炎等方面有良好效果[9-10]。人參總皂苷含量約為4%[2],其中Ra1、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1的含量占比超過95%,稀有皂苷含量極低[11],Rg3含量僅為0.000 3%~0.03%[3]。人參皂苷中的原有皂苷含量較高,但是不易被人體消化吸收,需要經(jīng)過腸道菌群轉(zhuǎn)化為稀有皂苷才能發(fā)揮生理功能,因此國內(nèi)外學(xué)者多采用化學(xué)法(酸解法、堿解法)[12-13]、生物法(酶解法、微生物轉(zhuǎn)化法)[14-15]將原有人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷,其中微生物轉(zhuǎn)化法具有成本低、綠色高效、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn),備受關(guān)注。

        乳酸菌是(lactic acid bacteria,LAB)是一類利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌,是人體腸道內(nèi)重要的益生菌群,能夠維持腸道菌群平衡[16]、提高機(jī)體免疫力[17]、抑制膽固醇的吸收[18]。乳酸菌常用作酸奶、乳酪、泡菜及其他發(fā)酵食品的發(fā)酵劑,具有綠色高效、安全、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn),在發(fā)酵制品領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛,如已有研究者利用乳酸菌發(fā)酵枸杞汁、柿子、樹莓等[19-21]。乳酸菌也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化,劉濤[2]利用乳酸菌發(fā)酵人參,將原有皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷并探究其抗氧化能力,朱珺等[22]從78株植物乳桿菌中篩選具有人參皂苷轉(zhuǎn)化能力的菌株。目前植物乳桿菌是最常用的乳酸菌發(fā)酵劑。研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌能夠產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶,β-葡萄糖苷酶能夠水解人參皂苷的β-葡萄糖苷,從而改變?nèi)藚⒃碥辗肿咏Y(jié)構(gòu)中所連接的糖苷配基,將原有皂苷轉(zhuǎn)化為活性更高、功能更強(qiáng)的稀有皂苷,提高稀有皂苷的含量,改善人參發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味,增強(qiáng)人參的生理功能,促進(jìn)腸道吸收[3,23-24]。

        本研究選擇唾液乳桿菌B19 WI2401、戊糖片球菌B06 WI2702、副干酪乳桿菌B16 WI2101、戊糖片球菌G16 WI7101、副干酪乳桿菌B16 WI2110、副干酪乳桿菌B16 NY2106、植物乳桿菌B16 NJ2201、副干酪乳桿菌B04 WI2501、副干酪乳桿菌B16 NY2107共9株菌對人參進(jìn)行發(fā)酵,通過定向微生物轉(zhuǎn)化將人參原有皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷,以稀有人參皂苷Rg3含量為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化,確定最適宜的發(fā)酵工藝,并分析發(fā)酵過程中人參皂苷生物轉(zhuǎn)化可能途徑,以期為人參發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        人參,完美(中國)日用品有限公司;菌株,中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司;人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品,北京索萊寶科技有限公司;小麥水解蛋白(純度>95%),中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司;乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純),默克股份兩合公司;乙酸銨(色譜級),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。

        HZQ-211C恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;1300 SERIES A2生物安全柜,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;IKA T25勻漿機(jī),德國IKA公司;pH211型精密pH計(jì),HANNA公司;LC-MS/MS 8060—三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津公司;BLBIO-5GJ發(fā)酵罐,上海百侖生物科技有限公司;GZ-5高速離心機(jī),德國Sigma離心機(jī)有限公司;KQ-250DE超聲儀,昆山市超聲儀器有限公司;LX-B50 L型滅菌鍋,合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 人參原料基本指標(biāo)檢測

        采用GB 5009.5—2016測定蛋白質(zhì)含量,GB 5009.6—2016測定脂肪含量,SN/T 4260—2015測定粗多糖含量,GB 5009.7—2016滴定法測定還原糖含量,GB 5009.88—2014測定總膳食纖維含量,GB 5009.4—2016測定原料灰分,GB/T 19506—2009測定人參總皂苷含量,采用pH211型精密pH計(jì)測定人參原料的pH值。

        1.2.2 菌株培養(yǎng)

        菌種保藏于-80 ℃,室溫解凍,以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種比例接種于液體培養(yǎng)基中,(36±1) ℃條件下培養(yǎng)24 h,活化2代待用。

        1.2.3 人參前處理

        稱取一定量的人參,按照1∶20(g∶mL)的料液比添加100 ℃沸水浸泡后,溫度自然冷卻過夜。用剪刀將人參剪成2 cm小段,破碎打漿3 min,添加0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))小麥水解蛋白粉作為氮源,蔗糖作為碳源,檸檬酸和碳酸鈣調(diào)整pH,115 ℃下滅菌20 min。

        1.2.4 人參發(fā)酵

        于生物安全柜中按照1%(體積分?jǐn)?shù))接種比例接種,置于30 ℃下發(fā)酵14 d,發(fā)酵結(jié)束后于沸水浴中滅菌30 min終止發(fā)酵,3 000 r/min離心10 min,取上清液待用。

        1.2.5 人參皂苷HPLC定量方法建立

        樣品制備:取人參上清液,用0.22 μm的過濾膜過濾,用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液稀釋50倍后待測。

        方法建立:色譜柱為ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm),流動相A為水溶液,B為5 mmol/L乙酸銨乙腈溶液。梯度洗脫程序:0~5.0 min,30%~50% B;5.0~8.0 min,50%~100% B;8.0~10.0 min,100% B;10.00~10.01 min,100%~30% B;10.01~12.00 min,30% B;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣體積1 μL;柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI),負(fù)離子掃描模式;離子噴霧電壓為+4.5 kV;霧化氣流速為氮?dú)?.0 L/min;加熱氣流速為氮?dú)?0 L/min;干燥氣流速為氮?dú)?0 L/min;接口溫度250 ℃;加熱器溫度400 ℃;離子源溫度300 ℃。利用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)進(jìn)行Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg3、Rh1、Rh2、CK、F2 12種人參皂苷的參數(shù)優(yōu)化。

        標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定:分別精密稱取12種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品,用50%甲醇溶液溶解配制成10 μg/mL混合溶液,將該混合液稀釋成156.25、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000 μg/L,以峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        樣品處理:取發(fā)酵前及終止發(fā)酵離心后的人參上清液,用0.22 μm膜過濾,稀釋50倍待測。

        實(shí)驗(yàn)方法精密度及穩(wěn)定性:通過對同一濃度的樣品重復(fù)進(jìn)樣和相同間隔時(shí)間段(8 h)分別進(jìn)樣,計(jì)算各組數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD,%),評價(jià)該方法的精密度和穩(wěn)定性。

        1.2.6 菌株篩選

        單一菌株篩選:根據(jù)自有菌庫情況,選擇唾液乳桿菌B19 WI2401、戊糖片球菌B06 WI2702、副干酪乳桿菌B16 WI2101、戊糖片球菌G16 WI7101、副干酪乳桿菌B16 WI2110、副干酪乳桿菌B16 NY2106、植物乳桿菌B16 NJ2201、副干酪乳桿菌B04 WI2501、副干酪乳桿菌B16 NY2107共9株菌進(jìn)行單一菌株篩選實(shí)驗(yàn),所選乳酸菌均為兼性厭氧菌。蔗糖添加量為2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),初始pH值為5.62,添加0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))小麥水解蛋白粉作為氮源,接種量為1%(體積分?jǐn)?shù)),于30 ℃下發(fā)酵12 d。

        復(fù)配菌株篩選:根據(jù)單一菌株發(fā)酵后Rg3的含量,選擇發(fā)酵效果最好的3株菌株,進(jìn)行復(fù)配實(shí)驗(yàn)研究。分別設(shè)計(jì)2個(gè)菌株復(fù)配和3個(gè)菌株復(fù)配共4組實(shí)驗(yàn),蔗糖添加量為5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),初始pH值為5.62,添加0.1%小麥水解蛋白粉作為氮源,接種量為1%(體積分?jǐn)?shù))(菌種比例為1∶1或1∶1∶1),于30 ℃下發(fā)酵12 d,選擇發(fā)酵后Rg3的含量最高的菌株復(fù)配組合,確定發(fā)酵終點(diǎn)。

        1.2.7 發(fā)酵工藝研究

        1.2.7.1 單因素試驗(yàn)

        設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)探究初始pH值、發(fā)酵溫度(℃)、蔗糖添加量(%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))對發(fā)酵工藝的影響,以發(fā)酵后Rg3的含量為評價(jià)指標(biāo),具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下:

        設(shè)計(jì)接菌量為1%,接菌比例為1∶1,蔗糖添加量為5%,發(fā)酵溫度為30 ℃,pH值分別為3、4、5、6、7,探究初始pH值對于發(fā)酵效果的影響;

        設(shè)計(jì)接菌量為1%,接菌比例為1∶1,蔗糖添加量為5%,pH值為6,發(fā)酵溫度為25、30、35、40、45 ℃,探究發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響;

        設(shè)計(jì)接菌量為1%,接菌比例為1∶1,pH值為6,發(fā)酵溫度為30 ℃,蔗糖添加量為3%、5%、7%、9%、11%探究蔗糖添加量對發(fā)酵效果的影響。

        1.2.7.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以初始pH值、發(fā)酵溫度、蔗糖添加量為考察因素,采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),以人參發(fā)酵后Rg3含量為響應(yīng)值,分析影響人參發(fā)酵各因素的交互作用,確定最佳工藝條件。中心組合實(shí)驗(yàn)水平如表1所示。

        表1 中心組合實(shí)驗(yàn)水平表

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        采用Design Expert 12進(jìn)行響應(yīng)面分析,Origin 8.5和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,每個(gè)處理3組平行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 人參原料基本成分分析

        稱取一定量的人參原料,破碎磨粉,過80目篩,測定基本成分,結(jié)果如表2所示。其中總皂苷含量為(3.12±0.58) g/100 g,約為3.12%;稀有皂苷Rg3含量為(0.012±0.006) g/100 g,約為0.012%。研究發(fā)現(xiàn),人參總皂苷含量約為4%,其中Rg3含量約為0.000 3%~0.03%,說明本原料中稀有皂苷Rg3含量極低,乳酸菌的轉(zhuǎn)化作用對于稀有皂苷Rg3含量的提升十分重要。測得人參原料前處理的pH值為5.60±0.24,乳酸菌適合生長繁殖的pH值在4~6左右,這說明人參原料前處理后的pH值適合乳酸菌生長,可用于菌株篩選實(shí)驗(yàn)研究。本研究中采用的乳酸菌最適pH值將在工藝實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行確定。

        表2 人參原料基本成分 單位:g/100 g

        2.2 人參皂苷定量及方法驗(yàn)證

        測定人參發(fā)酵前后的Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg3、Rh1、Rh2、CK、F2共12種人參皂苷,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間、前體離子和產(chǎn)物離子信息進(jìn)行定量分析。選取156.25、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000 μg/L共7個(gè)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定線性范圍。選擇混標(biāo)中的同一質(zhì)量濃度(5 000 μg/L)進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣(n=6),計(jì)算RSD,用于評價(jià)方法的精密度;選擇混標(biāo)中的同一質(zhì)量濃度(5 000 μg/L)進(jìn)行相同間隔時(shí)間段(8 h)的重復(fù)進(jìn)樣(n=6),計(jì)算RSD,用于評價(jià)方法的穩(wěn)定性,結(jié)果如表3所示。本研究方法的精密度良好,在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

        表3 十二種人參皂苷定量方法參數(shù)及驗(yàn)證

        2.3 菌株及其復(fù)配方案篩選結(jié)果

        2.3.1 菌株篩選

        本研究中采用唾液乳桿菌B19 WI2401、戊糖片球菌B06 WI2702、副干酪乳桿菌B16 WI2101、戊糖片球菌G16 WI7101、副干酪乳桿菌B16 WI2110、副干酪乳桿菌B16 NY2106、植物乳桿菌B16 NJ2201、副干酪乳桿菌B04 WI2501、副干酪乳桿菌B16 NY2107共4種菌種9個(gè)菌株進(jìn)行單一菌株篩選,以Rg3含量為評價(jià)指標(biāo),結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,Rg3含量升高,說明所選菌株均有轉(zhuǎn)化作用,能夠提高Rg3含量。發(fā)酵第8~10天時(shí),菌株B16 NY2107和B04 WI2501發(fā)酵液中Rg3含量明顯高于其他組,發(fā)酵第12天時(shí),菌株B16 NY2107、B16 WI2110和B04 WI2501發(fā)酵液中Rg3含量最高,分別達(dá)到(915.03±100.42)、(895.94±17.62)、(871.59±88.28) μg/L,且三者之間無顯著性差異,這說明本研究中副干酪乳桿菌B16 NY2107、B16 WI2110、B04 WI2501對人參稀有皂苷Rg3的轉(zhuǎn)化效果最好。劉濤[2]以市售人參提取物(易溶于水)為原料,選用植物乳桿菌GIM1.648、嗜酸乳桿菌GIM1.731、干酪乳桿菌GIM1.204、副干酪乳桿菌BNCC195633和發(fā)酵乳桿菌GIM1.985共5種菌種進(jìn)行人參皂苷生物轉(zhuǎn)化及發(fā)酵工藝研究,發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌GIM1.648產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的活性最高,其轉(zhuǎn)化人參稀有皂苷F2、Rg3、CK能力最強(qiáng)。張倩等[25]總結(jié)了植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、腸膜明串珠菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和德氏乳桿菌乳亞種生物轉(zhuǎn)化人參有效成分的能力,發(fā)現(xiàn)不同菌株對人參皂苷轉(zhuǎn)化效果不同,同一菌株對不同來源的人參原料中皂苷轉(zhuǎn)化效果也不同,這說明菌株的轉(zhuǎn)化能力及原料來源具有差異性。本研究選擇Rg3轉(zhuǎn)化效果最好的副干酪乳桿菌B16 NY2107、B16 WI2110和B04 WI2501進(jìn)行后續(xù)菌種復(fù)配研究。

        2.3.2 復(fù)配實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        人參皂苷分子結(jié)構(gòu)中連接的糖苷配基不同,皂苷種類也不同。乳酸菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的能力取決于其產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的能力,β-葡萄糖苷酶能夠水解人參皂苷的β-葡萄糖苷,從而將原有皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷[3,23-24]。單一菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷的能力取決于單一菌株產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的能力,而復(fù)合菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷的能力則取決于復(fù)合菌株之間的協(xié)同作用。復(fù)合菌株之間協(xié)同,可以促進(jìn)反應(yīng)體系中酶的多樣化和互補(bǔ)性,充分分解、溶出和利用人參組織中的有效成分和營養(yǎng)物質(zhì),從而提高稀有皂苷轉(zhuǎn)化能力。LEE等[26]利用釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、枯草芽孢桿菌組合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參稀有皂苷Rh1、F2、Rg3、CY,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率最高可分別達(dá)127.3%、63.5%、255.8%、226.6%[26]。AH等[27]利用植物乳桿菌KK-1和發(fā)酵乳桿菌KK-2混合發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌株比單一菌株發(fā)酵效果更好,混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化率達(dá)41%。但是菌株之間也會存在拮抗作用,不同菌株生長過程中產(chǎn)生競爭性抑制,皂苷轉(zhuǎn)化能力下降,薛兢兢[28]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌(乳桿菌+酵母菌)發(fā)酵效果不如單一乳桿菌株,這說明復(fù)合菌株發(fā)酵要綜合考慮菌株生長之間的協(xié)同作用和拮抗作用。

        根據(jù)單一菌株發(fā)酵后稀有皂苷Rg3含量,對所選擇的B16 NY2107、B04 WI2501、B16 WI2110進(jìn)行復(fù)合菌發(fā)酵,復(fù)配組合分別為B16 NY2107+B04 WI2501、B16 NY2107+B16 WI2110、B04 WI2501+B16 WI2110、B16 NY2107+B04 WI2501+B16 WI2110。蔗糖添加量為5%,接種量為1%(體積分?jǐn)?shù))(菌種比例為1∶1或1∶1∶1),于30 ℃下發(fā)酵12 d,確定發(fā)酵終點(diǎn)和復(fù)合方案,結(jié)果如圖2所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,B16 NY2107+B04 WI2501、B16 NY2107+B16 WI2110、B04 WI2501+B16 WI2110實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中,部分原有皂苷轉(zhuǎn)化為Rg3的同時(shí),Rg3也在發(fā)生降解,Rg3定量是綜合原有皂苷轉(zhuǎn)化作用和降解作用后的含量。B16 NY2107+B04 WI2501在發(fā)酵第9天,Rg3含量最高,達(dá)到(1 784.81±61.62) μg/L;B16 NY2107+B16 WI2110和B04 WI2501+B16 WI2110復(fù)配組合發(fā)酵第9天和第10天無顯著性差異,發(fā)酵后Rg3含量分別達(dá)到(1 410.15±84.3)、(1 384.06±48.96) μg/L和(1 425.96±71.46)、(1 496.21±21.75) μg/L。而3個(gè)菌株復(fù)合組B16 NY2107+B04 WI2501+B16 WI2110發(fā)酵后,Rg3含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,發(fā)酵12 d時(shí)含量達(dá)到最高,為(1 260.39±41.60) μg/L,這可能是由于3個(gè)菌株生長過程中的抑制作用,產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的能力下降,稀有皂苷Rg3轉(zhuǎn)化能力下降。綜上,最終復(fù)合菌株方案選擇分離自乳制品的副干酪乳桿菌B16 NY2107和分離自動物源固體飲料的副干酪乳桿菌B04 WI2501,發(fā)酵時(shí)間為9 d。

        圖2 復(fù)配菌株發(fā)酵后Rg3含量

        2.4 發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

        2.4.1 初始pH值對發(fā)酵效果的影響

        研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌在較酸環(huán)境下可以正常生長繁殖,最適于中性環(huán)境或者弱酸環(huán)境[29]。利用碳酸鈣和檸檬酸調(diào)整人參發(fā)酵液的初始pH值為3、4、5、6、7,探究初始pH值對人參稀有皂苷Rg3轉(zhuǎn)化作用的影響,結(jié)果如圖3所示。隨著pH值的增加,Rg3含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,pH值在4~6時(shí)發(fā)酵效果較好。乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的含量是衡量乳酸菌發(fā)酵程度的重要指標(biāo)[20],而乳酸含量是影響反應(yīng)體系pH值最主要的因素,當(dāng)反應(yīng)體系偏中性或堿性時(shí),乳酸菌產(chǎn)生的乳酸主要用于中性和堿性環(huán)境,乳酸菌生長較為緩慢;當(dāng)pH值過低時(shí),酸性環(huán)境會抑制乳酸菌的生長,也會抑制β-葡萄糖苷酶的活性,人參皂苷轉(zhuǎn)化效果較差。因此,選擇初始pH值為3~5進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。

        圖3 初始pH值對發(fā)酵后Rg3含量的影響

        2.4.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響

        選擇發(fā)酵溫度為25、30、35、40、45 ℃,探究發(fā)酵溫度對乳酸菌轉(zhuǎn)化Rg3能力的影響,結(jié)果如圖4所示。隨著發(fā)酵溫度的升高,Rg3含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí),Rg3含量最高,為(1 428.48±20.19) μg/L。研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵溫度對微生物的新陳代謝十分重要,溫度高低直接影響菌體活性[30],且會影響發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味和口感[21],因此,選擇35~45 ℃的發(fā)酵溫度進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。

        圖4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵后Rg3含量的影響

        2.4.3 蔗糖添加量對發(fā)酵效果的影響

        碳源是乳酸菌生長繁殖的必要條件,蔗糖添加量影響乳酸菌的生長繁殖,進(jìn)而影響人參稀有皂苷的轉(zhuǎn)化效果。選取蔗糖添加量為3%、5%、7%、9%、11%探究蔗糖添加量對乳酸菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg3能力的影響,結(jié)果如圖5所示。隨著蔗糖添加量的增大,Rg3含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)蔗糖添加量為7%時(shí),Rg3含量最高,達(dá)到(1 768.29±75.64) μg/L。蔗糖添加量是微生物生長繁殖的重要影響因素,蔗糖添加量過低時(shí),營養(yǎng)物質(zhì)缺乏,乳酸菌生長緩慢,發(fā)酵終點(diǎn)延長;蔗糖添加量過高時(shí),會導(dǎo)致反應(yīng)體系滲透壓增高,進(jìn)而影響乳酸菌的生長和代謝[20]。此外,研究發(fā)現(xiàn)蔗糖添加量也會影響發(fā)酵后產(chǎn)品的口感,一般蔗糖添加量為7%~9%時(shí),發(fā)酵產(chǎn)品感官評分較高[31],選擇5%~9%的蔗糖添加量進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。

        圖5 蔗糖添加量對發(fā)酵后Rg3含量的影響

        2.5 發(fā)酵工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

        根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)初始pH值、發(fā)酵溫度、蔗糖添加量3因素3水平實(shí)驗(yàn)探究各影響因素對Rg3轉(zhuǎn)化效果的影響。根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,以人參稀有皂苷Rg3含量(Y)為響應(yīng)值共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

        表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        采用Design Expert 8.0.6軟件擬合回歸多項(xiàng)參數(shù),得到人參稀有皂苷Rg3含量(Y)對初始pH值(A)、發(fā)酵溫度(B)、蔗糖添加量(C)的二次多項(xiàng)回歸模型方程:Y=1 709.96+315.67A-4.83B+195.26C-100.78AB+71.61AC-20.01BC-169.47A2-407.61B2-534.36C2。

        對回歸模型進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果如表5所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到的回歸模型P<0.01,模型極顯著;失擬項(xiàng)P=0.23>0.05,模型失擬項(xiàng)不顯著;R2=0.945 7,說明本次試驗(yàn)的模型相關(guān)度較好,置信度較高,可以用于分析和預(yù)測工藝條件。各項(xiàng)因素中,一次項(xiàng)A對Rg3含量有極顯著影響(P<0.01),C對于Rg3含量有顯著影響(P<0.05);二次項(xiàng)B2、C2均對Rg3含量有極顯著性影響(P<0.01),其他項(xiàng)對發(fā)酵后人參稀有皂苷Rg3含量無顯著影響(P>0.05)。綜合F值結(jié)果,在所取因素水平范圍內(nèi),各種因素對發(fā)酵后人參稀有皂苷Rg3含量的影響順序?yàn)锳(pH值)>C(蔗糖添加量)>B(發(fā)酵溫度)。

        表5 以Rg3含量為響應(yīng)指標(biāo)的回歸模型方差分析

        各因素間的交互作用對人參稀有皂苷Rg3轉(zhuǎn)化效果的響應(yīng)面圖和等高線如圖6所示。響應(yīng)面圖中坡度梯度越大,顏色變化越明顯,說明該因素對響應(yīng)值的影響作用越顯著。隨著發(fā)酵溫度、蔗糖添加量的增加,人參稀有皂苷Rg3的含量均呈現(xiàn)出先增加至拋物線最高點(diǎn)再下降的趨勢;而隨著初始pH值的增加,人參稀有皂苷Rg3的含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。其中初始pH值和發(fā)酵溫度的響應(yīng)面圖坡度最大,說明這兩個(gè)影響因素的交互作用最顯著。各影響因素交互作用的等高線呈現(xiàn)橢圓形或者馬鞍形時(shí),兩因素交互作用顯著,呈現(xiàn)圓形時(shí)兩因素交互作用不顯著[32],根據(jù)等高線圖可知,初始pH值和發(fā)酵溫度、初始pH值和蔗糖添加量的交互作用均強(qiáng)于發(fā)酵溫度和蔗糖添加量的交互作用。

        a-初始pH值和發(fā)酵溫度;b-初始pH值和蔗糖添加量;c-發(fā)酵溫度和蔗糖添加量

        綜上分析,利用Design Expert 8.0.6軟件得出Rg3含量最高(1 896.98 μg/L)的工藝參數(shù)為pH值5.0、發(fā)酵溫度39.33 ℃、蔗糖添加量7.51%。但是各條件在有限范圍內(nèi)進(jìn)行微調(diào),對Rg3含量影響較小。考慮實(shí)際工藝條件,選擇發(fā)酵最優(yōu)條件為初始pH值5.0、發(fā)酵溫度39.0 ℃、蔗糖添加量7.5%。在最優(yōu)參數(shù)下進(jìn)行5組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測得Rg3含量為(1 859.62±63.75) μg/L[即(92.981±3.188) mg/L人參發(fā)酵液],與理論值接近,該模型得到的優(yōu)化參數(shù)準(zhǔn)確性較高。

        2.6 發(fā)酵過程中人參皂苷生物轉(zhuǎn)化可能途徑分析

        在最優(yōu)工藝下,測定人參發(fā)酵前后12種人參皂苷含量,所得結(jié)果如圖7所示。

        圖7 發(fā)酵前后人參皂苷的含量

        12種人參皂苷中,Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1經(jīng)過發(fā)酵含量均呈現(xiàn)下降趨勢,分別降低68.36%、62.03%、70.94%、63.12%、89.30%、38.01%、80.57%。而Rg3、Rh1、Rh2、CK含量均呈現(xiàn)上升趨勢,其中Rg3和Rh1含量提升最為明顯,提高倍數(shù)均高于10倍。人參原料中Rh2、CK、F2含量較低,F2在發(fā)酵前后含量變化不明顯。這說明經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵作用,有部分原有皂苷轉(zhuǎn)化成稀有皂苷Rg3、Rh1、Rh2、CK。人參皂苷分子結(jié)構(gòu)中所連接的糖苷配基不同,皂苷種類也不同,稀有人參皂苷和原有皂苷結(jié)構(gòu)相比,C3、C6、C20位置上糖基的類型或數(shù)目不同,從而生理活性更強(qiáng)。乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶能夠水解人參皂苷結(jié)構(gòu)中C3、C6、C20位置上的糖基,將原有皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷[33]。劉濤[2]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶能夠水解C3、C20位置上的糖基,實(shí)現(xiàn)原人參二醇型皂苷Rb1/Rb2→Rd→F2→CK和Rb1→Rd→Rg3的轉(zhuǎn)化,因此Rb1、Rb2、Rd含量降低而Rg3、F2、CK含量升高。此外人參皂苷Rh1是三醇皂苷型Re、Rg1的次級代謝產(chǎn)物之一,故Re、Rg1濃度降低而Rh1濃度升高[2]。這與本研究結(jié)果一致。根據(jù)二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化機(jī)理,Rh2可以通過Rb1/Rc→Rd→Rg1→Rh2途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)化[2]。趙彩秀等[34]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶能夠斷裂Rb1 C20位上的糖苷鍵生成Rg3。陳玲[35]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒃藚⑷夹驮碥誖e的C6、C20位分別脫去一分子鼠李糖和葡萄糖生成Rh1。夏晚霞等[3]利用乳酸菌發(fā)酵人參皂苷發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化主要為Rb1→CK、Re→CK、Rb1→Rh1、Re→Rh1、Rb1→Rd→F2→Rg3→CK 5種途徑,且該轉(zhuǎn)化途徑與發(fā)酵過程中皂苷含量變化一致。綜上,本研究發(fā)酵過程中人參皂苷生物轉(zhuǎn)化可能途徑為Rb1/Rb2→Rd→Rg3、Rb1/Re/Rg1→Rh1、Rb1/Re→CK、Rb1→Rd→F2、Rb1/Rc→Rd→Rg1→Rh2。

        3 結(jié)論與討論

        本研究選用9株乳酸菌進(jìn)行人參發(fā)酵,以發(fā)酵后稀有人參皂苷Rg3含量作為評價(jià)指標(biāo),篩選出副干酪乳桿菌B16 NY2107、B16 WI2110、B04 WI2501共3株發(fā)酵效果較好的單菌株后進(jìn)行菌株間的復(fù)合菌發(fā)酵,確定最優(yōu)復(fù)合菌組合為副干酪乳桿菌B16 NY2107和B04 WI2501,發(fā)酵時(shí)間為9 d,接種量為1%,接種比例為1∶1。利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化,確定最優(yōu)發(fā)酵工藝為初始pH值5.0,發(fā)酵溫度39.0 ℃,蔗糖添加量7.5%,此條件下人參發(fā)酵后發(fā)酵液中Rg3含量為(92.981±3.188) mg/L,較發(fā)酵前含量提高14.86倍,所選擇的乳酸菌及復(fù)合方案發(fā)酵效果良好,說明菌種及其復(fù)配方案、最優(yōu)條件的選擇對人參皂苷轉(zhuǎn)化程度非常重要。對本研究發(fā)酵過程中人參皂苷生物轉(zhuǎn)化可能途徑進(jìn)行分析,人參皂苷生物轉(zhuǎn)化可能途徑為Rb1/Rb2→Rd→Rg3、Rb1/Re/Rg1→Rh1、Rb1/Re→CK、Rb1→Rd→F2、Rb1/Rc→Rd→Rg1→Rh2。綜上,乳酸菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷是一種綠色環(huán)保、安全高效的生物轉(zhuǎn)化方法,具有廣泛的應(yīng)用前景,未來可進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)大菌株及其復(fù)配方案、最優(yōu)發(fā)酵工藝的選擇,促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵技術(shù)在人參皂苷轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的應(yīng)用,同時(shí)需加強(qiáng)發(fā)酵過程皂苷定量研究,以明確人參發(fā)酵過程中皂苷的轉(zhuǎn)化機(jī)理。本研究確定了發(fā)酵過程中的菌株、復(fù)合方案及發(fā)酵工藝,并對可能的生物轉(zhuǎn)化途徑進(jìn)行分析,以期為乳酸菌在稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化研究中的利用及人參發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

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