王艾琳,危建安,韓 凌,盧傳堅(jiān),胡祥宇*

(1. 重慶市中醫(yī)院/重慶市第一人民醫(yī)院,重慶 400011; 2. 廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州 510120)

既往研究表明芍藥苷可降低Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平[1],抑制IMQ誘導(dǎo)銀屑病動物模型中炎癥細(xì)胞的浸潤[2],并且可通過NF-κB和ERK通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生和白細(xì)胞遷移從而發(fā)揮抗炎作用[3],在一定程度上闡明了芍藥苷治療銀屑病的機(jī)制。但基于DCs研究芍藥苷治療銀屑病的具體作用靶點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制尚不明確。

成熟樹突狀細(xì)胞(Mature dendritic cells,mDCs)通過淋巴管遷移至二級淋巴組織內(nèi),在此過程中其細(xì)胞表型發(fā)生了很大的變化,DCs成熟標(biāo)志物 CD83等表達(dá)量逐漸增多,并分泌多種趨化因子及細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10、IL-12、IL-23等),從而發(fā)揮調(diào)控T淋巴細(xì)胞的作用?？偟膩碚f,未成熟樹突狀細(xì)胞(Immature dendritic cells,imDCs)功能主要有抗原識別、攝取及處理,而mDCs的功能主要有抗原提呈及細(xì)胞因子分泌,可激活Na?ve CD4+T細(xì)胞,使其分化成Th1、Th2、Thl7或Treg細(xì)胞等。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c小鼠和C57小鼠,雄性,6周齡,體重18g～22g,購于廣東省醫(yī)學(xué)動中心。動物許可證書編號 SYXK(粵)2018-0094。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

芍藥苷(純度≥95%)購自成都曼斯特公司;紅細(xì)胞裂解液購自博士德生物公司;Imiquimod(IMQ)購自阿拉丁公司;RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司;LPS購自SIGMA公司;小鼠細(xì)胞因子集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)購自Pepro Tech公司;FITC Anti-Mouse CD11c、FITC Anti-Mouse CD11c、BV421 Anti-Mouse CD86、PerCP-Cy5.5 Anti-Mouse CD80、PE Anti-Mouse CD83、BV510 Anti-Mouse CD83、Alexa Fluro?647Anti-MouseI-A/I-E抗體購自BD公司;PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超高速流式細(xì)胞分選儀(BD,FACSAriaⅢ)、自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar,IC1000)、低溫高速離心機(jī)(Eppendorf,5810R)、超凈臺(Esco Airstream,ClassⅡ)、電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、顯微鏡(奧林巴斯,BX51T-PHD-J11)、CO2培養(yǎng)箱(Galaxy 170S)、熒光定量PCR儀(Thermo life,ViiA7)、紫外分光光度計(jì)(Thermo,SMA2000)、細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶(Corning公司)、全自動免疫磁珠細(xì)胞分選儀(Miltenyi,AutoMACS Pro)。

1.3 方法

1.3.1 BMDCs誘導(dǎo)培養(yǎng)

分離C57小鼠股骨、脛骨,收集骨髓腔中骨髓細(xì)胞,裂解紅細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整濃度為(0.5～1)×106/mL,鋪至6孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔2mL細(xì)胞,同時(shí)加入小鼠GM-CSF(20ng/mL)和IL-4(10ng/mL),37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);每2天輕晃培養(yǎng)板,更換3/4體積培養(yǎng)液,補(bǔ)足細(xì)胞因子;第6或7天,收集細(xì)胞。

1.3.2 Na?ve CD4+T細(xì)胞的分選

獲取BALB/c小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液,孵育Na?ve CD4+T細(xì)胞磁珠,MASC自動分選儀分選收集 Na?ve CD4+T細(xì)胞。

1.3.3 Na?ve CD4+T細(xì)胞與BMDCs共培養(yǎng)

BMDCs與Na?ve CD4+T細(xì)胞按1∶9的比例調(diào)整細(xì)胞濃度至0.5×106個(gè)/mL,鋪至6孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔2mL細(xì)胞,芍藥苷(5μM、20μM、100μM)提前干預(yù)24h,LPS(1μg/mL)或IMQ(10μg/mL)刺激共培養(yǎng)體系48h,5% CO237℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.3.4 流式檢測

收集細(xì)胞,標(biāo)記染色,采用FlowJo V10軟件分析流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。

1.3.5 熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

芍藥苷和IMQ(10μg/mL)干預(yù)BMDCs8h,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用ViiA7熒光定量PCR儀,采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。表1為引物上下游堿基序列。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對 BMDCs成熟的影響

流式檢測結(jié)果見圖1,與空白對照組對比,IMQ組BMDCs表面CD83、CD86表達(dá)顯著增高(P<0.0001),但芍藥苷不能抑制CD83、CD86的表達(dá)(P>0.05),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明芍藥苷不能抑制體外IMQ誘導(dǎo)的BMDCs成熟。

圖1 芍藥苷 IMQ干預(yù)的小鼠 BMDCs成熟的影響 注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,vs IMQ,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.0001,vs Control.

2.2 芍藥苷對 BMDCs 細(xì)胞因子 mRNA的影響

RT-PCR檢測結(jié)果見圖2,與空白對照組對比,IMQ造模組BMDCs中基因IL-1β、IL-6、IL-12A、IL-23、IFN-γ及TNF的mRNA的表達(dá)顯著增高(P<0.05);與IMQ組對比,5μM、100μM芍藥苷不能抑制BMDCs中上述細(xì)胞因子mRNA的表達(dá),甚至促進(jìn)炎癥因子基因IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-23和TNF的表達(dá)(P<0.05)。說明芍藥苷不能抑制 IMQ誘導(dǎo)的 BMDCs中炎癥因子 mRNA的表達(dá)。

圖2 芍藥苷對 IMQ 刺激 BMDCs 細(xì)胞因子 mRNA的影響 注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,vs IMQ,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.0001,vs Control.

2.3 芍藥苷對 BMDCs調(diào)控Treg細(xì)胞分化的影響

BMDCs與Na?ve CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)3天,收集細(xì)胞,流式檢測Na?ve CD4+T細(xì)胞的分化。結(jié)果見圖3,LPS組CD4+CD25+、CD4+CD152+細(xì)胞比例與空白對照相比顯著減少(P<0.01);5μM、20μM和100μM濃度芍藥苷干預(yù)后,CD4+CD25+、CD4+CD152+細(xì)胞比例具有增高的趨勢,其中20μM、100μM芍藥苷組CD4+CD25+、CD4+CD152+細(xì)胞比例顯著增高(P<0.01)。說明芍藥苷可能通過上調(diào)Treg細(xì)胞的表達(dá),從而發(fā)揮抗炎抗銀屑病的作用。

圖3 芍藥苷對 BMDCs控Th細(xì)胞分化的影響 注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,vs IMQ,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.0001,vs Control.

3 討論

張晗等[4]研究認(rèn)為芍藥苷可抑制不成熟DCs共刺激分子CD80、CD40和MHCⅡ的表達(dá);史冬梅等[5]發(fā)現(xiàn)芍藥苷抑制DCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表達(dá),從而抑制DCs表型成熟。但在本研究中,芍藥苷在體外未能抑制DCs表面共刺激分子CD83、CD86表達(dá),并且芍藥苷不能抑制IMQ刺激BMDCs中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-12A、IL-23、IFN-γ及TNF mRNA表達(dá)的增高。說明芍藥苷不能抑制DCs的成熟和 DCs產(chǎn)生炎癥因子。

Treg細(xì)胞對維持機(jī)體免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用,對效應(yīng)Th1及Th2細(xì)胞均具有抑制作用。據(jù)此推測,銀屑病患者皮損和外周血中的Treg細(xì)胞受損,其對效應(yīng)T細(xì)胞的抑制能力下降,造成免疫穩(wěn)態(tài)失衡。CD152在Treg分化發(fā)揮積極作用,芍藥苷可誘導(dǎo)Treg分化。鄭凱等[6]發(fā)現(xiàn)芍藥苷能誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向CD4+CD25+FoxP3+Treg分化并促進(jìn)IL-10mRNA的產(chǎn)生。本研究表明體外BMDCs與Na?ve CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,LPS刺激組CD4+CD25+、CD4+CD152+細(xì)胞比例顯著較空白對照顯著減少,而20、100μM芍藥苷可顯著增加CD4+CD25+、CD4+CD152+細(xì)胞比例。據(jù)此推測,芍藥苷可能是基于DCs促進(jìn)Na?ve CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化,從而發(fā)揮抗炎抗銀屑病的作用。

4 結(jié)論

通過本研究表明芍藥苷不能抑制IMQ誘導(dǎo)的BMDCs的成熟和BMDCs中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-12A、IL-23、IFN-γ及TNF mRNA的增高;但芍藥苷可以通過BMDCs促進(jìn)Na?ve CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化,從而發(fā)揮抗炎抗銀屑病的作用,為芍藥苷在銀屑病等自身免疫病治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。