胡麗萍,曹 夏,謝菊英,肖 麗

(湘南學(xué)院康復(fù)學(xué)院,湖南 郴州 423000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性骨病,典型特征為骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)損壞,從而易發(fā)生骨折。目前,我國(guó)約有2億人處于低骨量狀態(tài)[1],60歲及以上人群OP患病率為36%,隨著我國(guó)人口老齡化的日趨嚴(yán)重,OP已成為威脅中老年人健康的重要公共問(wèn)題[2]。運(yùn)動(dòng)作為一種重要的非藥物治療手段,能提高肌肉力量和改善平衡,在OP的預(yù)防中公認(rèn)應(yīng)作為首選。Irisin是骨骼肌對(duì)運(yùn)動(dòng)的應(yīng)答而產(chǎn)生的激素類的運(yùn)動(dòng)因子,是一種由骨骼肌分泌的Ⅲ型纖連蛋白[3]。OP作為骨代謝異常疾病,與irisin密切相關(guān)[4]。研究表明,骨骼肌中irisin的前體物質(zhì)FNDC5的表達(dá)在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)后顯著提高[3]。10周耐力訓(xùn)練后,健康人血液中irisin濃度是不運(yùn)動(dòng)人群的2倍[5]。絕經(jīng)女性骨折的發(fā)生率與irisin水平有關(guān)[6],而irisin可能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與抑制破骨細(xì)胞分化來(lái)影響骨代謝。但是,irisin對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)骨向分化的影響及其作用機(jī)制尚未明確。因此,本研究探討了運(yùn)動(dòng)對(duì)去勢(shì)SD大鼠骨代謝的影響及irisin調(diào)控骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs定向分化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

3月齡健康雌性SD大鼠(清潔級(jí)),100只,體重180～200g。(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī),分為空白組、模型組、假手術(shù)組、運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組,每組各20只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

血清骨堿性磷酸酶(BALP)試劑盒(上海碧云天生物),irisin酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(上海江萊生物科技有限公司),實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒、Trizol裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA 公司); CM-1000A-5702R 型低速離心機(jī);小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);雙能X骨密度檢測(cè)儀(佰泰科技有限公司)。

1.3 模型制備

雌性成年大鼠麻醉采用水合氯醛,0.35mL/100g,腹腔注射。麻醉成功后,將大鼠固定,切開皮膚、肌肉,暴露腹腔,在腎臟下約1cm處見到輸卵管和卵巢,先結(jié)扎摘除一側(cè)卵巢,再行對(duì)側(cè)卵巢切除,完整摘除后縫合切口。假手術(shù)組只摘除少許脂肪組織,其余同手術(shù)組。手術(shù)當(dāng)天結(jié)束后每只動(dòng)物皮下注射青霉素抗感染,術(shù)后禁食6小時(shí)。飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中3個(gè)月。三個(gè)月后測(cè)量大鼠腰椎及股骨的骨密度,并和術(shù)前的骨密度值比較,去勢(shì)前后BMD差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以確定骨質(zhì)疏松大鼠模型建立。

1.4 干預(yù)方法

空白組:正常SD大鼠,喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料,單籠喂養(yǎng),不做任何治療;模型組(PMOP模型):行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)造大鼠骨質(zhì)疏松癥模型,喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料,單籠喂養(yǎng),不做任何治療;假手術(shù)組:SD大鼠只切除少量腸系膜,保留卵巢,喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料,單籠喂養(yǎng),不做任何治療;運(yùn)動(dòng)組(PMOP模型+運(yùn)動(dòng)4周):大鼠造模成功后,進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,訓(xùn)練方式:20m/min×1h,5°向上坡度,訓(xùn)練5天,隨后休息2天,連續(xù)運(yùn)動(dòng)4周。模型+irisin注射組:行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)造大鼠骨質(zhì)疏松癥模型,每天一次irisin肌肉注射,每次100 μg/kg,注射4周;每周注射5天,休息2天,在最后一次注射后24小時(shí)處死所有大鼠。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

①腰椎和股骨骨密度(BMD):采用雙能X線骨密度儀測(cè)定;②血清irisin、Runx2及OPG指標(biāo)檢測(cè):采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中irisin、Runx2及OPG;③ALP、Runx2、OPG蛋白活性測(cè)定:對(duì)各組股骨下段行測(cè)定采用免疫組織化學(xué)染色法,光學(xué)顯微鏡下觀察ALP、Runx2及OPG蛋白表達(dá)水平。采用Image-pro plus 6.0軟件讀取IOD值進(jìn)行定量分析;④Rt-PCR檢測(cè)成骨分化調(diào)控因子Runx2及成骨活性的特異性標(biāo)志物OPG的基因表達(dá);⑤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs):處死大鼠后, 分離大鼠股骨及脛骨,用完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,同時(shí)收集沖洗液。高轉(zhuǎn)速離心獲取細(xì)胞沉淀液,置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),傳代培養(yǎng)。第14 d時(shí),將融合生長(zhǎng)的細(xì)胞以2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)進(jìn)行第3～4代細(xì)胞傳代時(shí),計(jì)算得出BMSCs表達(dá)量[7]。用ELISA法檢測(cè)OC和PINP含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)后各組大鼠骨密度比較

模型組腰椎、股骨BMD水平低于空白組和假手術(shù)組(P<0.05);空白組和假手術(shù)組腰椎、股骨BMD水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。連續(xù)干預(yù)4周后,與模型組相比,運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組腰椎及股骨BMD 均有所提高(P<0.05)。詳見表1。

表1 干預(yù)后各組大鼠骨密度比較

2.2 干預(yù)后各組大鼠血清irisin、Runx2及OPG比較

模型組大鼠血清irisin、Runx2、OPG含量低于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組大鼠血清irisin、Runx2、OPG含量均高于模型組(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組大鼠血清irisin、Runx2、OPG含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。詳見表2。

表2 干預(yù)后各組大鼠血清irisin、Runx2及OPG比較

2.3 干預(yù)后各組大鼠ALP、Runx2及OPG蛋白表達(dá)情況

與空白組和假手術(shù)組相比,模型組ALP、Runx2、OPG蛋白表達(dá)有所降低(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組大鼠ALP、Runx2、OPG蛋白表達(dá)均高于模型組(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組大鼠ALP、Runx2、OPG蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。詳見表3。

表3 干預(yù)后各組大鼠ALP、Runx2及OPG蛋白表達(dá)

2.4 干預(yù)后各組大鼠Runx2、OPG的基因表達(dá)情況

與空白組和假手術(shù)組相比,模型組Runx2、OPG mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組大鼠Runx2、OPG mRNA表達(dá)水平均高于模型組(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組大鼠Runx2、OPG mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。詳見表4。

表4 干預(yù)后各組大鼠Runx2、OPG mRNA表達(dá)

2.5 干預(yù)后各組大鼠BMSCs中IC增殖作用情況

與空白組和假手術(shù)組相比,模型組BMSCs中OC和PINP有所降低(P<0.05); 運(yùn)動(dòng)組和模型+鳶尾素注射組大鼠OC和PINP含量均提高(P<0.05), 運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組大鼠OC和PINP含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。詳見表5。

表5 干預(yù)后各組大鼠OC、PINP含量比較

3 討論

Bruce等研究發(fā)現(xiàn)irisin是一種新的肌肉因子[3]。作為骨骼肌的使者,irisin傳遞骨骼肌的信號(hào),溝通骨骼肌與外周組織的關(guān)系,因而被稱為“運(yùn)動(dòng)激素”。研究顯示,irisin能促進(jìn)Runx2的表達(dá)[8],而Runx2是成骨分化的調(diào)控因子。OPG是調(diào)節(jié)骨代謝的關(guān)鍵因子,成骨細(xì)胞分泌OPG,與RANK競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RANKL,抑制破骨前體細(xì)胞的分化成熟,以此降低破骨細(xì)胞活性,促使骨吸收與骨形成間形成平衡。ALP活性的高低是BMSCs成骨細(xì)胞分化的重要指標(biāo)。BMSCs是骨髓基質(zhì)重要組成成分,在不同誘導(dǎo)條件下,能夠向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同的細(xì)胞系分化,是人體內(nèi)成骨分化和骨形成的重要細(xì)胞來(lái)源[9]。

本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠BMD、irisin、Runx2、OPG、BMSCs、ALP蛋白水平含量均低于其他4組。干預(yù)后, 運(yùn)動(dòng)組和模型+irisin注射組大鼠BMD、irisin、Runx2、OPG、BMSCs、ALP 蛋白水平與模型組相比有所提高,推測(cè)運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)irisin增加ALP活性,促進(jìn)BMSCs增殖,上調(diào)Runx2、OPG mRNA表達(dá),對(duì)成骨及破骨雙重調(diào)節(jié),進(jìn)而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能通過(guò)調(diào)節(jié)irisin含量,直接或間接影響影響骨量的表達(dá);而irisin能提高成骨細(xì)胞分化活性,促進(jìn)去卵巢大鼠BMSCs定向分化,進(jìn)而提高骨密度,防治和延緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,應(yīng)用irisin可能是臨床上改善患者骨質(zhì)疏松的一種潛在的治療手段。