戚 運(yùn),陳蘇寧

0 引言

術(shù)后腸梗阻(Postoperative ileus,POI)是腹部手術(shù)后的常見(jiàn)并發(fā)癥[1]。常以腹脹、進(jìn)食后嘔吐、無(wú)排氣排便為主要臨床表現(xiàn),約占腹部手術(shù)患者的10%～30%[2]。其發(fā)生與術(shù)中麻醉用藥、神經(jīng)反射抑制、炎癥反應(yīng)、應(yīng)激等多種因素有關(guān)[3]。術(shù)后腸梗阻不僅會(huì)延長(zhǎng)患者的住院時(shí)間,增加圍手術(shù)期費(fèi)用,而且影響患者手術(shù)后恢復(fù),增加再次手術(shù)和術(shù)后感染的風(fēng)險(xiǎn)[3]。小承氣湯(Xiaochengqi Decoction)源自《傷寒論》,由大黃、枳實(shí)、厚樸三味藥組成,具有輕下熱結(jié)、除滿消痞之功效[4]。小承氣湯作為一種常用的中藥方劑,在國(guó)內(nèi)各醫(yī)療機(jī)構(gòu)得到廣泛應(yīng)用,既有成方或顆粒劑可供選擇,也可根據(jù)患者具體情況調(diào)配。小承氣湯對(duì)術(shù)后腸梗阻有顯著的治療效果,但其作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新興的藥物分析方法,其基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析,能夠構(gòu)建“有效成分-靶點(diǎn)-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò),從整體角度揭示藥物與疾病的相互作用[5],這種方法對(duì)于復(fù)雜成分藥物,特別是中藥復(fù)方的作用機(jī)制分析具有明顯優(yōu)勢(shì)。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,從有效成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路等方面,分析了小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻的可能機(jī)制,并為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小承氣湯有效成分及靶點(diǎn)的篩選 從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP,https：//tcmsp-e.com/)中檢索小承氣湯中大黃、枳實(shí)、厚樸三味中藥的全部化學(xué)成分,并根據(jù)藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄性質(zhì)(Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion,ADME),篩選出口服生物利用度(Oral bioavailability,OB) ≥30%和類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18 的化學(xué)成分及其相應(yīng)靶點(diǎn)[6]。

1.2 術(shù)后腸梗阻相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以“Postoperative ileus”為關(guān)鍵詞,分別在Genecards(https：//www.genecards.org/)、Disgent(https：//www.disgenet.org/)、OMMI(https：//www.omim.org/)和TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)[7]4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索術(shù)后腸梗阻的相關(guān)靶點(diǎn),并綜合各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果,得出術(shù)后腸梗阻的可能作用靶點(diǎn)。

1.3 小承氣湯與術(shù)后腸梗阻靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化及映射 將篩選出的小承氣湯和術(shù)后腸梗阻相關(guān)靶點(diǎn),分別在Unipro(https：//www.uniprot.org/)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,選擇“Human”作為種屬條件,得到統(tǒng)一的基因名稱。然后將這些基因名稱在Venny2.1平臺(tái)(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中進(jìn)行映射,找出小承氣湯和術(shù)后腸梗阻共有的靶點(diǎn),并用韋恩圖表示。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interactions,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將小承氣湯和術(shù)后腸梗阻的共有靶點(diǎn)基因輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//cn.string-db.org/),應(yīng)用多重蛋白分析功能,選擇“Homo sapiens”作為物種,設(shè)定相互作用閾值為“medium confidence(0.400)”,構(gòu)建了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。在該圖中,節(jié)點(diǎn)表示由單個(gè)蛋白編碼基因產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì),邊表示蛋白質(zhì)之間的相互作用證據(jù)。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將小承氣湯和術(shù)后腸梗阻的共有靶點(diǎn)基因輸入David數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/),并設(shè)置Identifier為“OFFICE_GENE_SYMBOL”,species為“Homo sapiens”,List Type為“Gene List”。然后,選擇Gene_Ontology中的“GOTERM_BP_DIRECT”“GOTERM_CC_DIRECT”“GOTERM_MF_DIRECT ”和Pathways中的“KEGG_PATHWAY”,進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.6 有效成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖 將小承氣湯的有效成分、靶點(diǎn)和通路的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合,并用Cytoscape 3.9.0 軟件繪制了“有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 小承氣湯有效成分及靶點(diǎn)的篩選 本文從 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索了小承氣湯的全部化學(xué)成分,共計(jì)269種,其中大黃92種,枳實(shí)65種,厚樸139種。然后根據(jù) ADME標(biāo)準(zhǔn),以 OB≥30% 和 DL≥0.18 為篩選條件,剔除了沒(méi)有靶點(diǎn)的化學(xué)成分,最終得到了31種有效化合物和147個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。這些化合物包括大黃10種,枳實(shí)19種,厚樸2種。按照 OB 值的大小排序,31種化合物的來(lái)源、OB 值和 DL 值如表1所示。

表1 小承氣湯部分有效成分基本信息

2.2 術(shù)后腸梗阻相關(guān)靶點(diǎn)的篩選及藥物與疾病靶點(diǎn)的映射 在Genecards、Disgent、OMMI和TTD 4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中,以“postoperative ileus”為關(guān)鍵詞,檢索術(shù)后腸梗阻的相關(guān)靶點(diǎn),并去除重復(fù)項(xiàng),共得到286個(gè)靶點(diǎn)。然后,將這些靶點(diǎn)在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,得到統(tǒng)一的基因名稱。將這些基因名稱在Venny2.1平臺(tái)中進(jìn)行映射,找出小承氣湯和術(shù)后腸梗阻共有的靶點(diǎn),共計(jì)36個(gè),并用韋恩圖表示,如圖1所示。

圖1 小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將小承氣湯和術(shù)后腸梗阻的36個(gè)共有靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,并在圖2中展示。在該圖中,節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì),邊表示蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)包含36個(gè)節(jié)點(diǎn)和306個(gè)邊,平均節(jié)點(diǎn)度為17。

圖2 小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將小承氣湯和術(shù)后腸梗阻的共有靶點(diǎn)基因輸入David數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示,共有282個(gè)生物學(xué)過(guò)程被富集,主要包括對(duì)藥物的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、趨化因子生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)等;34個(gè)分子生物學(xué)功能被富集,主要包括細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、蛋白質(zhì)同二聚活性等;28個(gè)細(xì)胞學(xué)組分被富集,主要包括細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜外側(cè)等(見(jiàn)圖3)。此外,共有10條 KEGG 信號(hào)通路被富集,按照P值從小到大排序,主要包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等(見(jiàn)圖4)。這些結(jié)果在圖4中用氣泡圖表示,其中氣泡的大小反映了該通路涉及的基因數(shù)量,顏色反映了富集顯著性。

圖3 小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻靶點(diǎn)GO基因注釋分析圖

圖4 小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻靶點(diǎn)KEGG富集分析圖

2.5 有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 采用Cytoscape 3.9.0 軟件繪制小承氣湯和術(shù)后腸梗阻的“有效成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖5)。圖5清晰地顯示了小承氣湯的31種有效成分、36個(gè)靶點(diǎn)蛋白和10條作用通路與術(shù)后腸梗阻的關(guān)聯(lián)。

圖5 小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻“有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

術(shù)后腸梗阻是指腹部手術(shù)后腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙或機(jī)械性阻塞,導(dǎo)致腸內(nèi)容物不能正常通過(guò)的一種常見(jiàn)并發(fā)癥。術(shù)后腸梗阻的治療原則是及時(shí)診斷、糾正水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂、消除感染和炎癥、解除梗阻和恢復(fù)腸道功能[8]。治療方法主要分為保守治療和手術(shù)治療。保守治療適用于部分或不完全性梗阻,無(wú)絞窄或壞死的腸段,無(wú)明顯腹膜炎體征或全身中毒癥狀的患者。保守治療包括禁食水、胃腸減壓、營(yíng)養(yǎng)支持、維持水電解質(zhì)、酸堿平衡、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、生長(zhǎng)抑素、糖皮質(zhì)激素、抗菌藥物等西醫(yī)措施,以及行氣通腑、消積化滯等中藥措施[9]。西醫(yī)保守治療可以為患者提供生命支持,糾正水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂,消除感染和炎癥,減少并發(fā)癥。然而,其不能直接解除梗阻原因,可能延長(zhǎng)腸道功能恢復(fù)時(shí)間,增加住院費(fèi)用,部分患者可能需要再次手術(shù)。中藥保守治療可以根據(jù)患者的體質(zhì)和證型進(jìn)行個(gè)體化治療,通過(guò)多途徑給藥,能夠促進(jìn)腸道功能恢復(fù)。然而,中藥研究顯示,小承氣湯能夠抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、降低血管通透性、保護(hù)胃腸功能等[10]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,從有效成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路等方面分析了小承氣湯治療POI的可能機(jī)制。

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到的小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻的核心化合物有大黃酸(Rhein)、大黃素(Emodin)、蘆薈大黃素(Aloe-emodin)、枸櫞苦素(Poncimarin)、異枸櫞苦素(Isoponcimarin)、新橙皮苷(Neohesperidin)等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,大黃中富含大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素等蒽醌類成分[11]。大黃素具有膽堿樣作用,可興奮平滑肌M膽堿受體,加快腸蠕動(dòng),同時(shí)可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞分泌的TNF2A,抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)[12]。大黃酸可顯著抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)LTB4和LTC4的生物合成,同時(shí)抑制內(nèi)毒素激發(fā)的巨噬細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高,并提高細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平,從而達(dá)到減輕或阻斷炎癥介質(zhì)所導(dǎo)致的瀑布樣效應(yīng)[13]。此外,大黃酸、大黃素和蘆薈大黃素均可通過(guò)抑制細(xì)菌的核酸和蛋白質(zhì)的合成達(dá)到抗菌目的[14]。厚樸的主要成分為酚類物質(zhì),酚類含量最高、起主要藥效的為厚樸酚與和厚樸酚[15]。厚樸酚是一種具有糖皮質(zhì)激素樣非選擇性抗炎活性的化合物。藥理研究發(fā)現(xiàn),厚樸酚能夠直接抑制iNOS、COX-2和5-LO的活性,從而阻斷NO、PGs和LTs的合成和釋放,厚樸酚還能夠抑制組胺釋放,進(jìn)而發(fā)揮廣譜的抗炎效果[16]。枳實(shí)中含有新橙皮苷等黃酮類成分[17],可改善FD大鼠的胃排空和腸蠕動(dòng)[18],同時(shí)顯著抑制COX-2、IL-6、TNF-α的表達(dá),從而發(fā)揮抗炎作用[19]。

從PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),小承氣湯通過(guò)PPARG、IL-10、IL1B、NOS2、PTGS2、TNF等靶點(diǎn)共同發(fā)揮治療作用。白介素10(Interleukin-10,IL-10) 是一種重要的抗炎細(xì)胞因子,可抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)以及炎癥細(xì)胞因子的釋放[20]。研究表明[21],IL-10在術(shù)后腸功能恢復(fù)中起著不可替代的作用,外源性IL-10可阻止其發(fā)生。預(yù)防性應(yīng)用外源性重組人白細(xì)胞介素10可作為預(yù)防臨床術(shù)后腸梗阻的一種治療方法。腫瘤壞死因子(Tumour Necrosis Factor,TNF)是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可通過(guò)NF-κB和AP-1等通路,促進(jìn)IL-1、IL-2、IL-6等炎性因子的激活[22]。研究表明,電針足三里(ST36)或足三里(ST36)聯(lián)合天舒(ST25)可改善POI小鼠腸道運(yùn)動(dòng),其機(jī)制可能與抑制TNF表達(dá)有關(guān)[23]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloprotein,MMP9)是一類蛋白酶,負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECMs)的降解和重構(gòu)。在炎癥過(guò)程中介導(dǎo)白細(xì)胞的遷移[24]。研究發(fā)現(xiàn),MMP-9介導(dǎo)POI小鼠和大鼠腸肌內(nèi)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[25]。抑制MMP-9活性,可減少免疫細(xì)胞向腸肌的聚集,防止平滑肌收縮功能的喪失。

GO功能富集分析結(jié)果顯示,小承氣湯對(duì)術(shù)后腸梗阻的作用主要體現(xiàn)在以下方面：①生物學(xué)過(guò)程,包括趨化因子生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、缺乏配體時(shí)的外源性凋亡信號(hào)通路、平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)等;②分子功能,包括細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性等;③細(xì)胞組分,包括細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜外側(cè)等。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,小承氣湯對(duì)術(shù)后腸梗阻的作用主要涉及以下信號(hào)通路：①腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)是急性和慢性系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),能夠通過(guò)激活下游的IKK/NF-κB和MAPK,誘導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)[26]。研究表明,加味小承氣湯能夠顯著降低硫代乙酰胺(TAA)所致肝損傷小鼠TNF-α水平,發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[27]。②T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)是免疫系統(tǒng)有效應(yīng)答的關(guān)鍵事件,能夠在T細(xì)胞受體特異性識(shí)別抗原提呈細(xì)胞表面MHC提呈的抗原肽后,通過(guò)蛋白激酶、銜接蛋白等多種分子相互作用,形成一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),激活并誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分化,參與免疫反應(yīng)[28]。③HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)由缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1調(diào)節(jié)。HIF-1是細(xì)胞代謝和缺氧所致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在炎癥反應(yīng)、生理應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[29]。HIF與天然免疫的中樞調(diào)節(jié)因子NF-κB之間具有密切協(xié)同關(guān)系,HIF能夠介導(dǎo)缺氧中性粒細(xì)胞NF-κB的活化,并以TLR-4依賴的方式促進(jìn)LPS刺激巨噬細(xì)胞中NF-κB調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)[30]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,初步探討了小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻的可能機(jī)制。通過(guò)數(shù)據(jù)整合分析,發(fā)現(xiàn)小承氣湯的多個(gè)成分作用于PPARG、IL-10、IL1B、NOS2、PTGS2、TNF等靶點(diǎn),從而調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等與免疫和炎癥相關(guān)的信號(hào)通路。這一結(jié)果與以往的臨床觀察相符,支持了小承氣湯治療術(shù)后腸梗阻的有效性。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),小承氣湯的部分靶點(diǎn)涉及細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡等過(guò)程,這為進(jìn)一步揭示小承氣湯的作用機(jī)制提供了新的線索。然而,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法也存在一些不足。首先,該方法依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)和算法的質(zhì)量,可能存在數(shù)據(jù)缺失、錯(cuò)誤或過(guò)時(shí)的問(wèn)題;其次,該方法只能進(jìn)行定性分析,無(wú)法反映成分和靶點(diǎn)之間的定量關(guān)系;最后,該方法只能進(jìn)行預(yù)測(cè)和推斷,并不能取代實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床試驗(yàn)。因此,在后續(xù)的工作中,我們將對(duì)篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,并進(jìn)行更大規(guī)模和更長(zhǎng)期的臨床試驗(yàn),以提高預(yù)測(cè)的精確度和可信度。