毛治尉,王東偉,武永新,張 濤

0 引言

冠心病是目前世界范圍內(nèi)常見的心臟病之一,是我國心臟病病例中住院率和死亡率最高的疾病類型[1]。冠心病主要是由于冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致冠脈痙攣和冠脈管腔狹窄改變,使冠狀動脈供血相對不足,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)缺氧、缺血[2]。血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞,血管內(nèi)皮炎癥貫穿了冠狀動脈粥樣硬化的始終,能引起血管平滑肌細(xì)胞異常增殖、凋亡、血管內(nèi)皮損傷等[3]。因此,研究如何調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的功能,對治療冠心病具有重要意義。白樺脂酸是大量存在于樺木屬植物,如白樺樹皮中的一種五環(huán)三萜類化合物。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),白樺脂酸具有抗炎、抗腫瘤、抗HIV、抗?jié)兊壬锘钚訹4-5]。但關(guān)于白樺脂酸在冠心病等心血管疾病中的作用和影響還鮮有報道。自噬是一種進化保守的分解代謝途徑,又被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[6]。研究發(fā)現(xiàn),激活腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)/Unc-51樣自噬激活激酶1(Unc-51-like kinase 1,ULK1)信號通路可以促進細(xì)胞自噬[7]。因此,白樺脂酸能否通過調(diào)控該信號通路影響冠心病患者血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)過程是值得探究的。本研究將以大鼠血管平滑肌細(xì)胞為研究對象,探究白樺脂酸對冠心病大鼠血管平滑肌細(xì)胞自噬和凋亡的影響和具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只SPF級SD大鼠,雄性,7～10周齡,體重190～220 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,許可證號：SYXK(滬)2022-0012。所有大鼠實驗前在溫度22～24 ℃、相對濕度40%～55%、12 h光照環(huán)境下飼養(yǎng)7 d。本實驗經(jīng)鄭州市中心醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理號：20220018)。

1.2 主要試劑與儀器 白樺脂酸購自中國科學(xué)院成都生物研究所;垂體后葉素購自南京新貝藥業(yè)有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;PBS、胰蛋白酶購自美國Cell Signaling Technology公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所;RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;α-平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;FITC標(biāo)記的IgG二抗購自北京中杉金橋公司;AMPK、mTOR、ULK1、LC3、Bax、Bcl-2、Beclin-1、GAPDH一抗和相應(yīng)二抗購自Abcam公司。Western印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠冠心病模型的建立 參考文獻方法,構(gòu)建大鼠冠心病模型[8]。將24只SD大鼠隨機分為對照組和模型組,每組12只。對照組大鼠采用普通飼料正常飼養(yǎng),模型組大鼠每日使用高脂飼料進行喂養(yǎng)(含10%豬油、87.3%基礎(chǔ)飼料、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶)。連續(xù)喂養(yǎng)6周,間隔2周大鼠腹腔注射垂體后葉素(30 μg/kg),1次/d,連續(xù)注射3 d,對照組大鼠注射等量的生理鹽水。末次注射后30 min進行心電圖檢查,出現(xiàn)T波高聳、ST段抬高超過0.1 mV、心律不齊,說明造模成功[9]。

1.3.2 血管平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 造模成功后處死所有大鼠,解剖,分別取兩組SD大鼠的胸主動脈血管平滑肌,按組織貼塊法進行培養(yǎng)。于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用0.1%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化傳代細(xì)胞。細(xì)胞傳代3次后用于后續(xù)實驗。在顯微鏡下觀察細(xì)胞,細(xì)胞應(yīng)呈梭形或長梭形,可以重疊生長,高低起伏,呈“峰與谷”樣生長狀態(tài)。用α-SM-actin單抗通過免疫熒光染色法鑒定血管平滑肌細(xì)胞的特異性肌動蛋白。具體操作：用4%多聚甲醛固定細(xì)胞后,加入山羊血清孵育,加入一抗α-SM-actin單抗(1∶100)、FITC標(biāo)記的IgG二抗(1∶100)、加入DAPI工作液,最后加入抗熒光猝滅劑,在激光共聚焦顯微鏡下觀察和拍照。

1.3.3 細(xì)胞分組與處理 細(xì)胞經(jīng)鑒定為血管平滑肌細(xì)胞后,取對數(shù)生長期血管平滑肌細(xì)胞,以1×104個/孔的密度接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,將從對照組大鼠中分離培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞記為正常組(Control組),將從模型組大鼠中分離培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞隨機分為模型組(Model組)、低濃度(20 μmol/L)白樺脂酸組(BA-L組)、高濃度(40 μmol/L)白樺脂酸組(BA-H組)[10]和高濃度(40 μmol/L)白樺脂酸+AMPK抑制劑(10 μmol/L)Compound C組(BA-H+CC組)[11]。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入相應(yīng)藥物進行處理。

1.3.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期血管平滑肌細(xì)胞,以1×104個/孔的密度,將細(xì)胞接種于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,對各組細(xì)胞進行分組,并加入相應(yīng)藥物進行處理,每組設(shè)置6個復(fù)孔。實驗共設(shè)置3個檢測時間點：24 h、48 h和72 h。加入相應(yīng)藥物處理24、48、72 h后,每孔加入10 μl的CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下每孔的光密度(OD)值,OD值在一定程度上反映了細(xì)胞活力。

1.3.5 細(xì)胞流式術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取處理過的各組細(xì)胞加入胰酶消化,離心棄去上清液收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞懸液的密度為1×106個/ml,加入PBS洗滌2次,加入400 μl Binding Buffer重懸,加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI試劑,混勻后室溫避光孵育15 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.6 雙熒光體系觀察血管平滑肌細(xì)胞自噬小體 取對數(shù)生長期的血管平滑肌細(xì)胞,以1×105個/ml的密度接種在6孔板中,當(dāng)細(xì)胞匯合至80%后,將mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h[12]。將細(xì)胞按“1.3.3”中進行分組和處理后,繼續(xù)培養(yǎng)6 h。棄去培養(yǎng)基,加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min,加入DAPI染色劑對細(xì)胞核進行染色。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)綠色和紅色LC3的亮點(自噬體)的數(shù)量。

1.3.7 RT-qPCR實驗檢測大鼠血管平滑肌細(xì)胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表達 取對數(shù)生長期的血管平滑肌細(xì)胞進行相應(yīng)分組與處理。加入Trizol試劑提取細(xì)胞RNA。將提取的RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以此為模板,進行PCR擴增。反應(yīng)體系為20 μl,反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火40 s,一共循環(huán)40次。使用2-ΔΔCt方法計算各組細(xì)胞AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表達量。引物序列設(shè)計如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.8 Western blot檢測大鼠血管平滑肌細(xì)胞中AMPK/mTOR/ULK1信號通路和自噬相關(guān)蛋白表達 取對數(shù)生長期的血管平滑肌細(xì)胞進行相應(yīng)分組與處理。加入RIPA裂解液提取血管平滑肌細(xì)胞總蛋白,使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下將膜在脫脂奶粉中封閉2 h,隨后在4 ℃下與一抗AMPK(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、ULK1(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Beclin-1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)孵育過夜。次日,室溫下將膜與相應(yīng)二抗(1∶5 000)孵育2 h,再用TBST洗滌膜3次,加入ECL顯色劑進行顯色。以GAPDH為內(nèi)參,使用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 血管平滑肌細(xì)胞的鑒定 當(dāng)培養(yǎng)至第4～6天時,光鏡下觀察到細(xì)胞大部分呈長梭形,小部分呈多角形或不規(guī)則形;當(dāng)培養(yǎng)至第10～14天時,細(xì)胞呈典型的“峰-谷”樣結(jié)構(gòu)(圖1)。血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后,激光共聚焦顯微鏡觀察到標(biāo)志性分子α-SM-actin在細(xì)胞質(zhì)中沿縱軸呈絲狀排列。α-SM-actin在細(xì)胞質(zhì)發(fā)出綠色熒光,細(xì)胞核被染為藍色,表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞(圖2)。

圖1 原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)(100×)

圖2 免疫熒光檢測α-SM-actin在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(400×)

2.2 白樺脂酸對各組血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 與Control組相比,Model組細(xì)胞活力(48 h、72 h)顯著升高(P<0.05);與Model組相比,BA-H組細(xì)胞活力(48 h、72 h)顯著降低(P<0.05),BA-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與BA-L組相比,BA-H組細(xì)胞活力(48 h、72 h)顯著降低(P<0.05);與BA-H組相比,BA-H+CC組細(xì)胞活力(48 h、72 h)顯著升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞活力的比較

2.3 白樺脂酸對各組血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡率的影響 與Control組細(xì)胞凋亡率(12.58%±0.93%)相比,Model組細(xì)胞凋亡率(2.24%±0.16%)顯著降低(P<0.05);與Model組相比,BA-H組細(xì)胞凋亡率(10.86%±0.89%)顯著增加(P<0.05),BA-L組(2.36%±0.20%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與BA-L組相比,BA-H組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與BA-H組相比,BA-H+CC組細(xì)胞凋亡率(2.87%±0.33%)顯著降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 流式術(shù)檢測血管平滑肌細(xì)胞凋亡

2.4 白樺脂酸對各組血管平滑肌細(xì)胞自噬的影響 使用雙熒光體系觀察血管平滑肌細(xì)胞中綠色和紅色LC-3Ⅱ顆粒(自噬體),結(jié)果顯示,Control組、Model組血管平滑肌細(xì)胞中無明顯的自噬小體出現(xiàn)。BA-H組血管平滑肌細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯的自噬小體。BA-L組血管平滑肌細(xì)胞中的自噬小體較少。與BA-H組相比,BA-H+CC組血管平滑肌細(xì)胞中的自噬小體減少(圖5)。

圖5 雙熒光體系觀察血管平滑肌細(xì)胞中的自噬小體

2.5 白樺脂酸對血管平滑肌細(xì)胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA表達的影響 與Control組相比,Model組細(xì)胞中AMPK、ULK1 mRNA表達顯著降低(P<0.05),mTOR mRNA表達顯著升高(P<0.05);與Model組相比,BA-H組細(xì)胞中AMPK、ULK1 mRNA表達顯著升高(P<0.05),mTOR mRNA表達顯著降低(P<0.05),BA-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與BA-L組相比,BA-H組細(xì)胞中AMPK、ULK1 mRNA表達顯著升高(P<0.05),mTOR mRNA表達顯著降低(P<0.05);與BA-H組相比,BA-H+CC組細(xì)胞中AMPK、ULK1 mRNA表達顯著降低(P<0.05),mTOR mRNA表達顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組血管平滑肌細(xì)胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA表達比較(n=6)

2.6 白樺脂酸對血管平滑肌細(xì)胞中AMPK/mTOR/ULK1信號通路和自噬相關(guān)蛋白表達的影響 與Control組相比,Model組血管平滑肌細(xì)胞中AMPK、ULK1、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著降低(P<0.05),mTOR、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05);與Model組相比,BA-H組血管平滑肌細(xì)胞中AMPK、ULK1、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著升高(P<0.05),mTOR、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05),BA-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與BA-L組相比,BA-H組血管平滑肌細(xì)胞中AMPK、ULK1、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著升高(P<0.05),mTOR、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05);與BA-H組相比,BA-H+CC組血管平滑肌細(xì)胞中AMPK、ULK1、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著降低(P<0.05),mTOR、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05),見表3及圖6。

圖6 Western blot檢測血管平滑肌細(xì)胞中AMPK/mTOR/ULK1信號通路和自噬相關(guān)蛋白表達

表3 各組血管平滑肌細(xì)胞中AMPK/mTOR/ULK1信號通路和自噬相關(guān)蛋白表達的比較(n=6)

3 討論

冠心病多發(fā)病于40歲以上的人群,是臨床常見的心血管疾病之一,且致死率在心血管疾病中最高,嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[13]。目前,臨床治療冠心病主要依靠腔內(nèi)介入和旁路血管移植術(shù),這兩種治療手段在提高患者近期療效中效果較好,但長期預(yù)后較差,容易受到冠脈再狹窄的制約[14]。因此,尋找治療冠心病安全有效的藥物,在提高療效的同時提高患者預(yù)后是亟待解決的重要課題之一。研究顯示,血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成冠狀動脈血管壁的肌層部分,在冠心病的病理狀態(tài)下,平滑肌細(xì)胞異常增殖,合成并分泌膠原纖維蛋白,進一步促進管腔狹窄和管壁硬化[15]。血管平滑肌細(xì)胞主要有2種表型：收縮型和分泌型。正常生理狀態(tài)下,血管平滑肌細(xì)胞為收縮型,能夠維持血管的張力;在病理狀態(tài)下血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分泌型,具有強大的增殖能力和遷移活性[16]。因此,深入研究血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)功能對治療冠心病具有重要作用。細(xì)胞自噬是一種溶酶體的降解途徑,對細(xì)胞生存、分化和機體發(fā)育、穩(wěn)態(tài)具有重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn),自噬在感染、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥等疾病中起到保護作用,當(dāng)自噬水平減弱,可能會導(dǎo)致阿爾茨海默病、心血管疾病的發(fā)生[18]。Beclin1、LC3是自噬發(fā)生過程中的重要蛋白,其蛋白表達量可以作為自噬發(fā)生的標(biāo)志。本研究采用高脂飲食構(gòu)建冠心病大鼠模型,從冠心病大鼠的胸主動脈血管平滑肌中分離培養(yǎng)原代血管平滑肌細(xì)胞,經(jīng)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞。結(jié)果顯示,與Control組相比,Model組血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表達顯著上升,細(xì)胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著下降,表明模型建立成功。

白樺脂酸是一種天然的五環(huán)羽扇烷結(jié)構(gòu)的三萜化合物,主要從樺木科的樹皮中提取而來[19]。相關(guān)研究表明,白樺脂酸能夠增強細(xì)胞自噬而發(fā)揮治療相關(guān)疾病的作用,如白樺脂酸能通過AMPK-mTOR-TFEB信號通路增強自噬,抑制脊髓細(xì)胞焦亡,促進脊髓損傷的恢復(fù)[20]。Zhang等[21]研究表明,白樺脂酸通過Bmi-1/ROS/AMPK-mTOR-ULK1信號通路誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞自噬依賴性凋亡。本研究結(jié)果顯示,與Model組相比,BA-H組血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表達顯著下降,細(xì)胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著上升,表明白樺脂酸能促進冠心病大鼠血管平滑肌細(xì)胞的自噬和凋亡。

AMPK/mTOR/ULK1信號通路是調(diào)控細(xì)胞自噬的重要信號通路[22]。當(dāng)細(xì)胞受到饑餓、缺氧、氧化應(yīng)激等刺激后,AMPK通過磷酸化被激活,并降低mTOR的磷酸化水平,增加Ser317位點磷酸化ULK1的表達,最終激活自噬[23-24]。Lin等[25]研究發(fā)現(xiàn),雙酚A通過誘導(dǎo)AMPK/mTOR/ULK1信號通路,促進卵巢顆粒細(xì)胞的自噬,導(dǎo)致卵巢功能異常。Gui等[26]研究發(fā)現(xiàn),紅景天苷通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路上調(diào)細(xì)胞自噬,減輕缺氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖。本研究結(jié)果顯示,與Control組相比,Model組細(xì)胞AMPK、ULK1 mRNA和蛋白表達顯著降低,mTOR mRNA和蛋白表達顯著升高。與Model組相比,BA-H組細(xì)胞AMPK、ULK1 mRNA和蛋白表達顯著升高,mTOR mRNA和蛋白表達顯著降低。結(jié)果表明,白樺脂酸可能通過激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1信號通路,促進冠心病大鼠血管平滑肌細(xì)胞的自噬和凋亡。為了驗證此猜想,我們用AMPK抑制劑Compound C來干預(yù)高濃度的白樺脂酸組,結(jié)果表明,Compound C減弱了白樺脂酸對血管平滑肌細(xì)胞自噬和凋亡的促進作用。

綜上所述,白樺脂酸可能通過激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1信號通路,促進冠心病大鼠血管平滑肌細(xì)胞的自噬和凋亡。本研究的不足之處是僅在細(xì)胞水平進行了初步探究,后續(xù)還需深入到體內(nèi)實驗中進行驗證。