單寶雪,劉秀坤,肖延軍,展曉孟,黃金鑫,劉百川,張玉梅,李豪圣,劉建軍,高 欣,曹新有,趙振東

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東青島 266109;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/小麥玉米國家工程中心/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/山東省小麥技術(shù)創(chuàng)新中心,山東濟南 250100)

小麥?zhǔn)鞘澜缰饕Z食作物,也是中國第三大糧食作物[1],可為世界人口提供20%的卡路里和蛋白質(zhì)[2],也是人體微量元素的重要來源[3]。小麥株高與抗倒伏能力[4]具有顯著的相關(guān)性,是影響小麥產(chǎn)量的重要因素之一。據(jù)研究,矮化或降低株高與產(chǎn)量潛力的大幅增加有關(guān)[5]。自19世紀(jì)60年代的綠色革命以來,我國在小麥育種工作中引進(jìn)了小麥矮稈、半矮稈基因Rht,小麥產(chǎn)量因此上升[6]。合理利用矮稈基因現(xiàn)已成為小麥育種的主要策略之一[7],小麥株高是多基因控制的數(shù)量性狀,主要受矮稈基因控制[8],還受到大量數(shù)量性狀位點的影響,同時根據(jù)遺傳背景和環(huán)境條件的不同而表現(xiàn)出差異[9-10]。目前已經(jīng)被命名的矮稈基因有27個,分布在2AS、2BL、2DS、3BS、4BS、4DS、5AL、5DL、6AS、7AS和7BS等染色體上[11],多由突變產(chǎn)生。

Rht-B1b和Rht-D1b半矮稈基因來源于日本品種農(nóng)林10號(Norin 10),分別定位于4B和4D染色體短臂,目前存在于70%的全球商品化小麥品種中[12]。Ellis[13]開發(fā)的小麥Rht-B1b和Rht-D1b基因特異性引物,利用等位基因特異性標(biāo)記進(jìn)行基因分型。1996年,郭保宏等[14]檢測我國76個矮稈小麥品種中的矮稈基因分布情況,單獨含有Rht-B1b或Rht-D1b基因的品種分別占21%和72%,同時含有Rht-B1b和Rht-D1b基因的品種占7%。含有Rht-B1b基因的小麥品種生產(chǎn)上累計推廣面積河南省最大,為524萬hm2,含有Rht-D1b基因的品種以山東省累計推廣面積最大,為1 575萬hm2。2005年慕美財?shù)萚15]對150份山東小麥品種的Rht-B1b和Rht-D1b基因進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明20.67%含有Rht-B1b基因,有54.00%含有Rht-D1b基因,同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因的品種僅占3.33%。2017年周曉變等[16]對黃淮麥區(qū)246份小麥材料進(jìn)行矮稈基因檢測,結(jié)果表明41.46%含有Rht-B1b基因,63.41%含有Rht-D1b基因,同時含有Rht-B1b和Rht-D1b基因的材料占45%。2018年朱浩等[17]檢測202份小麥的矮稈基因分布情況,發(fā)現(xiàn)10.89%含有Rht-B1b基因,73.76%含有Rht-D1b基因。在過去20多年間大量研究表明,Rht-B1b、Rht4-D1b基因的分布頻率逐年提高,黃淮麥區(qū)Rht-D1b基因的分布頻率高于Rht-B1b基因,表明Rht-D1b基因的利用更廣泛,普及率更高。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展,DNA芯片技術(shù)由于其快捷和精確的特性在QTL定位中得到了廣泛的應(yīng)用。廖思敏等[18]利用55K SNP芯片,在W7268和川育12衍生的RIL群體中檢測到兩個控制株高的穩(wěn)定的主效QTL:QPh.cib-4B.1和QPh.cib-2D.1。王盈等[19]在高代分離群體中檢測到一個控制株高的新位點:Qph-6A,可以解釋8.33%～13.93%的表型變異。前人分別利用芯片、GWAS技術(shù)以及分子標(biāo)記對多個小麥群體進(jìn)行QTL定位,在不同環(huán)境下檢測到大量的株高QTL位點,廣泛地分布于基因組染色體上,但由于檢測到的QTL位點數(shù)量多、效應(yīng)小,導(dǎo)致在生產(chǎn)上應(yīng)用較少。因此挖掘在多環(huán)境下穩(wěn)定的QTL位點,在矮化育種中加以應(yīng)用,是目前亟需解決的問題。

為發(fā)掘新的株高相關(guān)QTL位點,分析矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b在遺傳群體內(nèi)的降稈效應(yīng),本研究選用黃淮北片育成的濟麥44×濟麥229衍生的重組自交系(RIL)群體為材料,結(jié)合株高表型數(shù)據(jù),分析不同基因型的降稈效應(yīng)并進(jìn)行株高QTL定位,以期為發(fā)掘新的矮稈基因和矮化育種提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用黃淮北片育成的小麥新品種濟麥44和濟麥229衍生的重組自交系(F2∶6,285個株系)群體為材料。其中濟麥44含有Rht-D1b基因,濟麥229含有Rht-B1b基因。

1.2 田間試驗設(shè)計

試驗材料于2020-2021年種植在濟南試驗基地(21JN)、2021-2022年種植在濟南(22JN)和濟陽(22JY)試驗基地。試驗點采用隨機區(qū)組設(shè)計,1.5 m×6 m小區(qū)種植,機播180 g。按常規(guī)方法進(jìn)行大田試驗管理。

1.3 表型鑒定及統(tǒng)計分析

小麥自然成熟收獲前,對濟南、濟陽的重組自交群體分別進(jìn)行株高的數(shù)據(jù)測定,分別進(jìn)行3次重復(fù),取平均值用于表型和遺傳分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Execl 2016對測量的株高數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析,在QTL IciMapping V4.0軟件(http://www.isbre ed.net)假設(shè)基因型的固定效應(yīng),使用ANOVA函數(shù)跨環(huán)境計算最佳線性無偏估計(BLUE)。采用SAS 9.4軟件(SAS institute,http://www.sas.com)進(jìn)行方差分析(ANOVA)。利用Origin 2022b繪制矮稈基因降稈效應(yīng)圖。利用R studio繪制群體株高的相關(guān)性熱圖。

1.5 DNA提取

利用Tiangen快捷植物基因組DNA提取系統(tǒng)來提取小麥苗期的幼嫩葉片DNA,利用NANO DROP 2000檢測DNA濃度及質(zhì)量,將終濃度調(diào)至50 ng/μL,并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴增

根據(jù)Ellis[13]發(fā)表的序列設(shè)計引物。引物對BF/WR1可擴增Rht-B1a野生型基因,引物對BF/MR1可擴增Rht-B1b突變型基因,引物對DF2/WR2可擴增Rht-D1a野生型基因,引物對DF1/MR2可擴增Rht-D1b突變型基因。

試驗分別以小偃6號(含矮稈基因Rht-B1b)、濟南17(含矮稈基因Rht-D1b)做陽性對照,以中國春(不含任何矮稈基因)做陰性對照,來驗證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。引物由上海生工生物股份有限公司合成,序列信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

PCR反應(yīng)體系:10 μL體系中,DNA模板(已進(jìn)行稀釋)1 μL,正、反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL,Mix 5 μL,ddH2O 2 μL。

PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性15 s,退火15 s,退火溫度見表1,72 ℃延伸15 s,35個循環(huán),72 ℃延伸5 min。

PCR擴增產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,緩沖體系為1×TAE緩沖液,150 V電壓電泳30 min,凝膠成像儀下觀察條帶并照相。

1.7 遺傳圖譜的構(gòu)建與QTL定位

利用中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份公司開發(fā)的55K小麥專用芯片進(jìn)行基因型檢測,刪除雜合率≥10%和缺失率≥10%的標(biāo)記,用TASSEL V5.0軟件將偏分離標(biāo)記(Min∶Max=0.3∶0.7)過濾,使用QTL IciMapping V4.2軟件整理剩余的標(biāo)記。利用JionMap4構(gòu)建全基因組遺傳圖譜,然后利用Map Chart繪制遺傳圖譜。利用軟件QTL IciMapping 4.1進(jìn)行QTL分析,選擇復(fù)合完備區(qū)間作圖(ICIM-ADD)法,做1 000次重復(fù),臨界閾值P=0.05,作為判定QTL存在與否的標(biāo)準(zhǔn)。QTL的置信區(qū)間(CI)為LRs峰值±1所在位置。QTL命名以“Q+性狀名稱縮寫+染色體編號+編號”。在超過一半的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)相同性狀的QTL認(rèn)為是穩(wěn)定的QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及重組自交系的株高表型分析

濟南和濟陽基地的基本氣候和土壤情況見表2,兩地塊在小麥播種前土壤均進(jìn)行旋耕處理。在三個環(huán)境下對RIL群體的285個株系進(jìn)行株高的測定,結(jié)果(表3、圖1)表明,21JN中RIL群體的株高范圍為34.33～103.00 cm,平均值為64.53 cm;22JN中RIL群體的株高范圍為44.67～100.00 cm,平均值為78.07 cm;22JY中RIL群體的株高范圍為45.33～119.00 cm,平均值為91.33 cm。由于濟陽試驗田的土壤速效磷及速效鉀含量整體高于濟南試驗田,年平均降雨量相近,造成22JN和22JY之間的株高存在差異。濟南試驗基地2022年小麥生長期間及小麥拔節(jié)期降水量(395.7和40.2 mm)高于2021年(324.4和27.8 mm);進(jìn)而造成2022年群體的平均株高高于2021年。21JN、22JN未發(fā)生倒伏情況,22JY由于株高較高、灌漿后期出現(xiàn)大風(fēng)降雨天氣,23.5%的小區(qū)發(fā)生了不同程度的點片倒伏。因此群體內(nèi)家系間株高變異幅度較大。三個環(huán)境下株高表型數(shù)據(jù)的偏度與峰度(表3)的絕對值均小于1。

圖1 21JN(A)、22JN(B)、22JY(C)和BLUE(D)環(huán)境下RIL群體株高的頻率分布Fig.1 The frequency distribution of plant height of RIL population in 21JN(A), 22JN(B), 22JY(C), and BLUE(D) environments

表2 濟南和濟陽基地氣候和土壤情況Table 2 Climate and soil conditions of JN and JY locations

表3 RIL群體的株高表現(xiàn)Table 3 Plant height of RIL population

株高的遺傳力在21JN、22JN和22JY三個環(huán)境分別為0.9728、0.9837和0.9886,表明株高主要受遺傳因子的影響。由圖1可知,重組自交系的株高在不同的環(huán)境下均表現(xiàn)為近似正態(tài)分布,群體中株高出現(xiàn)了超親分離的現(xiàn)象,符合數(shù)量性狀遺傳的特點,可以進(jìn)行株高性狀的QTL定位。

2.2 重組自交系的矮稈基因Rht-B1b與Rht-D1b的檢測

引物對BF/WR1和BF/MR1分別用來檢測Rht-B1a和Rht-B1b基因, BF/WR1可以從含有Rht-B1a基因的材料中擴增出一條237 bp的特異性片段,BF/MR1可以從含有Rht-B1b基因的材料中擴增出一條237 bp的特異性片段。結(jié)果驗證濟麥44不含Rht-B1b基因,濟麥229含有Rht-B1b基因,在285份重組自交系材料中,113份材料含有Rht-B1b基因,占總數(shù)的39.65%;172份材料含有Rht-B1a基因,占總數(shù)的60.35%。

引物對DF2/WR2和DF1/MR1分別用來檢測Rht-D1a和Rht-D1b基因,DF2/WR2可以從含有Rht-D1a基因的材料中擴增出一條254 bp的特異性片段,DF1/MR1可以從含有Rht-D1b基因的材料中擴增出一條264 bp的特異性片段。結(jié)果驗證濟麥44含有Rht-D1b基因,濟麥229不含Rht-D1b基因,在285份重組自交系材料中,102份含有Rht-D1b基因,占全部材料的35.79%;183份含有Rht-D1a基因,占全部材料的64.21%。同時含有Rht-B1b與Rht-D1b兩基因的有29份,占全部材料的10.18%。

2.3 Rht-B1b和Rht-D1b對株高的遺傳效應(yīng)

將285個RIL家系的基因檢測結(jié)果與其對應(yīng)株高表型進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)在三個環(huán)境下含有Rht-B1b基因的株系株高均大于基因型Rht-B1a的株系(圖2A),其中21JN、22JN和22JY三個環(huán)境下表現(xiàn)為顯著或極顯著的差異,相較于Rht-B1a,Rht-B1b可降低株高8.45 cm(10.75%)、6.76 cm(8.10%)和8.83 cm(9.41%)。根據(jù)圖2B,在三個環(huán)境下含有Rht-D1b基因的株系株高均大于基因型Rht-D1a的株系,其中21JN、22JN和22JY三個環(huán)境下均表現(xiàn)為顯著或極顯著的差異,相較于Rht-D1a,Rht-D1b可降低株高11.68 cm(14.68%)、12.74 cm(14.93%)和16.60 cm(17.36%)。

根據(jù)圖2C,Rht-B1b和Rht-D1b對小麥群體株高的聯(lián)合效應(yīng)可以顯著降低株高,根據(jù)群體中Rht-B1b基因與Rht-D1b基因單獨存在的株高性狀對比,可以看出Rht-D1b基因的降稈效應(yīng)要大于Rht-B1b基因。且Rht-B1b和Rht-D1b基因同時存在可顯著降低株高8.85～35.80 cm(11.05%～34.82%)。

矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b存在的前提下,重組自交群體內(nèi)株高仍有較大差異,兩基因無法解釋全部的株高變異,因此利用已構(gòu)建的285個家系,利用55K芯片進(jìn)行分析,期望找到新的控制株高的QTL,可以更合理地解釋小麥群體株高的差異分布。

2.4 遺傳連鎖圖譜

經(jīng)過小麥55K SNP芯片分析,親本間具有多態(tài)性的SNP標(biāo)記共有53 064個,其中2 344個骨架標(biāo)記用于遺傳圖譜的構(gòu)建。獲得的遺傳圖譜含有29個連鎖群,全長3 349.95 cM,覆蓋基因組全部21條染色體,其中1A、2B、2A、4B、5D、6B、7A、7B分別有兩個連鎖群。B基因組標(biāo)記最多(936個)且長度最短,為1 091.06 cM。A基因組有815個標(biāo)記,D基因組含593個標(biāo)記,覆蓋染色體長度分別為1 123.57、1 091.06和1 135.32 cM。(表4)。平均標(biāo)記密度為1.43/cM。

表4 “濟麥44×濟麥229”RIL群體的高密度遺傳圖譜Table 4 Distribution and length of the markers in genetic map of the RILs derived from “Jimai 44×Jimai 229”

2.5 株高相關(guān)QTL位點

共檢測出6個與株高性狀相關(guān)的QTL(表5,圖3),共分布在1A、1B、2B、4B和4D(2)共5條染色體上。單個QTL可以解釋0.81%～32.32%的表型變異,其中可以被穩(wěn)定檢測到主效的QTL有2個,分別是位于4B和4D染色體的Qph.saas-4B.1、Qph.saas-4D.2,分別可以解釋10.40%～20.12%和22.25%～32.32%的表型變異。Qph.saas-2B.2在兩個環(huán)境下被檢測到,可以解釋0.81%～1.52%的表型變異,Qph.saas-4D.1在一個環(huán)境和BLUE值被檢測到,可以解釋21.58%～22.88%的表型變異。還有兩個QTL:Qph.saas-1A、Qph.saas-1B在一個環(huán)境中被檢測到,可以解釋1.88%～2.23%的表型變異。

表5 “濟麥44×濟麥229”RIL群體株高性狀的QTLTable 5 QTLs for plant height of the RIL population derived from “Jimai 44×Jimai 229”

3 討論

2014年許琦等[20]研究發(fā)現(xiàn)Rht-B1b基因的降稈效應(yīng)達(dá)到10.4%,Rht-D1b的降稈效應(yīng)達(dá)到16.7%。Wang等[21]和Akman等[22]發(fā)現(xiàn),Rht-D1b能夠降低16%～30%的株高。丁夢云等[23]檢測Rht-B1b基因的降稈效應(yīng)為8.2%～8.9%。Flintham[24]檢測發(fā)現(xiàn)Rht-B1b和Rht-D1b單獨存在時的平均降稈效應(yīng)為15.5%,兩基因同時存在時的降稈效應(yīng)可達(dá)到42%。Richards[25]證明Rht-B1b和Rht-D1b單基因的降稈效應(yīng)在23%,而基因組合的降稈效應(yīng)可達(dá)到47%。Butlerd等[26]檢測到單個Rht-B1b和Rht-D1b單基因的降稈效應(yīng)平均達(dá)到14.8%,兩基因同時存在的降稈效應(yīng)達(dá)到35.7%。Miralles等[27]和Wurschum等[28]研究發(fā)現(xiàn)Rht-B1b和Rht-D1b基因單獨存在時的平均降稈效應(yīng)在24%左右。不同研究中得到的降稈效應(yīng)的差異表明基因型背景和環(huán)境條件對株高也有影響。

本試驗利用Ellis[13]發(fā)表的4對特異性分子標(biāo)記對矮稈基因Rht- B1b和Rht-D1b在群體中的分布情況進(jìn)行檢測,由于標(biāo)記的多態(tài)性強且擴增出的目的片段條帶清晰,該分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于小麥分子標(biāo)記輔助育種。小麥矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b是隱性基因,不適宜在早代篩選,通過利用分子標(biāo)記輔助選擇可以提前確定含有矮稈基因的個體,進(jìn)而加速小麥育種的進(jìn)程[29]。通過對285份RIL材料的Rht-B1b和Rht-D1b基因進(jìn)行檢測,結(jié)果表明82份材料含有Rht-B1b基因,占39.65%;78份材料含有和Rht-D1b基因,占35.79%;29份材料同時含有Rht-B1b和Rht-D1b基因,占10.18%。本研究中得到Rht-B1b和Rht-D1b兩基因的分布情況略低于前人研究的結(jié)論,這可能與本試驗選取的材料有關(guān),RIL群體的基因主要來源于兩親本,具有基因組合的局限性,因此與其他群體的基因分布情況有差異。

根據(jù)本研究結(jié)果,Rht-B1b可降低株高6.76～8.83 cm,降稈效應(yīng)在8.10%～10.75%;Rht-D1b可降低株高11.68～16.60 cm,降稈效應(yīng)達(dá)到14.68%～17.36%。Rht-B1b和Rht-D1b基因同時存在可顯著降低株高8.85～35.80 cm,降稈效應(yīng)達(dá)到11.05%～34.82%。綠色矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b的廣泛應(yīng)用,極大地促進(jìn)了綠色革命的進(jìn)程,不僅保證了小麥的穩(wěn)產(chǎn),更促進(jìn)了小麥產(chǎn)量潛力的提高[30]。與1990年前后的品種相比,Rht-B1b的頻率從8.6%提高至32.2%,Rht-D1b的頻率從36.2%提高至53.4%[31],基因分布頻率的顯著提高表明矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b在中國不同環(huán)境下的小麥生產(chǎn)中都獲得了大量的應(yīng)用。

本研究通過構(gòu)建高密度遺傳圖譜定位到兩個穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL位點,分別是Qph.saas-4B.1和Qph.saas-4D.2。試驗前期已驗證親本濟麥44含有Rht-D1b,濟麥229含有Rht-B1b。Qph.saas-4B.1的物理位置在31.85～150.62 Mb之間,Rht-B1b基因在4B染色體上的33.61 Mb處,表明Qph.saas-4B.1就是Rht-B1b基因。Qph.saas-4D.2在16.15～37.49 Mb之間,Rht-D1b在4D染色體的18.78 Mb處,表明Qph.saas-4D.2就是Rht-D1b基因。Mao等[32]利用Meta分析法,確定了30個與株高相關(guān)的QTL,其中P13對應(yīng)矮稈基因Rht-B1b,定位在Xgwm495-Xfba78側(cè)翼序列之間;P14對應(yīng)矮稈基因Rht-D1b,定位在Xwmc419-Xwmc457側(cè)翼序列之間,本研究所結(jié)果與其定位結(jié)果相近。

本研究中定位到的Qph.saas-4D.1位于4D染色體11.87～16.15 Mb之間,可以解釋22.23%的表型變異,在多個環(huán)境中被檢測到。梁子英等[33]定位到多個株高及其相關(guān)性狀QTL位點,位于Xwmc473-Xwmc285區(qū)間內(nèi),可以解釋13.49%～63.42%的表型變異。劉賓等[34]定位到一個株高QTL:Oph4D-2,位于Xbarc334-Xwmc331之間。本研究定位到的株高相關(guān)位點Qph.saas-4D.1與上述多個QTL位點物理位置重疊,可能為同一QTL,是一個新的矮稈基因,目前未被克隆利用。Qph.saas-4D.1可以解釋22.23%的表型變異,是“濟麥44×濟麥229”衍生的重組自交群體在Rht-B1b和Rht-D1b兩個主效矮稈基因存在的情況下,群體中仍存在較大的株高分離現(xiàn)象的主要原因之一。本研究中的定位到的QTL位點Qph.saas-2B.2位于2B染色體678.84～680.04 Mb之間,與前人研究報道的QTL位點不重合,可以解釋2.73%～2.82%的表型變異,在兩個環(huán)境下被檢測到,可能為一個新的微效株高QTL位點,后續(xù)可進(jìn)一步開展相關(guān)研究并在矮稈育種中加以利用。

4 結(jié)論

本研究利用濟麥44與濟麥229構(gòu)建的285份RIL家系對Rht-B1b與Rht-D1b基因及其降稈效應(yīng)進(jìn)行檢測,結(jié)果表明82份材料含有Rht-B1b基因,降稈效應(yīng)達(dá)到8.10%～10.75%;78份材料含有Rht-D1b基因,降稈效應(yīng)達(dá)到14.68%～17.36%;29份材料同時含有Rht-B1b和Rht-D1b基因,兩基因同時存在的降稈效應(yīng)達(dá)到11.05%～34.82%。構(gòu)建高密度遺傳圖譜對群體矮稈基因進(jìn)行檢測,共檢測到6個QTL,其中兩個被穩(wěn)定檢測到的QTL分別為已克隆的Rht-B1b和Rht-D1b基因。此外,Qph.saas-2B.2和Qph.saas-4D.1可在2個環(huán)境下被檢測到,Qph.saas-2B.2可能為影響株高相關(guān)新QTL位點,用于小麥矮化育種實踐中,為進(jìn)一步矮稈基因的精細(xì)定位和矮化育種提供理論參考。