鄭 鍇, 羅秀玲, 張瑋豪, 劉宇利, 李玉明, 廖尚高

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.神經(jīng)外科;2.頭頸腫瘤科,貴州 貴陽(yáng) 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550004

垂體腺瘤(pituitary adenoma,PA)是起源于垂體前葉的良性腫瘤,是繼神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腦膜瘤之后的第3大常見原發(fā)性腦腫瘤,約占所有顱內(nèi)腫瘤的15%[1]。臨床上無(wú)功能的PA主要表現(xiàn)為對(duì)周圍結(jié)構(gòu)的占位效應(yīng),包括視交叉和垂體,分泌性PA會(huì)刺激某些下丘腦-垂體-器官軸并表現(xiàn)為肢端肥大癥和庫(kù)欣病等[2]。PA的臨床體征、神經(jīng)病理學(xué)特征、增殖活性和可能侵入周圍解剖結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)模式等影響因素存在巨大異質(zhì)性,對(duì)其病程的預(yù)測(cè)非常具有挑戰(zhàn)性[3]。治療PA的最終目標(biāo)是延長(zhǎng)患者生存期和改善患者生活質(zhì)量,雖然絕大多數(shù)PA是良性的,可以通過(guò)手術(shù)、放療及藥物進(jìn)行治療,但有些PA對(duì)上述治療無(wú)反應(yīng)[2,4]。因此,尋找與PA密切相關(guān)、可對(duì)其預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物十分必要?？缒?超家族(trans-membrane 4 superfamily,TM4SF)蛋白可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞間的凝聚力,減少吞噬和侵襲,抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移,KAI1/CD82是TM4SF的成員,可抑制大多數(shù)腫瘤的轉(zhuǎn)移,與腫瘤侵襲和預(yù)后顯著相關(guān)[5]。有研究發(fā)現(xiàn),KAI1/CD82在某些惡性腫瘤中表達(dá)降低,與惡性進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān),如甲狀腺狀微癌、鼻咽癌等[6-7]。本研究旨在探討KAI1/CD82在PA中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響,為臨床中PA的防治提供新的研究方向?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院自2020年5月至2021年10月收治的72例PA患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):臨床初次確診為PA[8];無(wú)家族性疾病病史;既往無(wú)手術(shù)史;術(shù)前無(wú)放療、化療史。排除標(biāo)準(zhǔn):合并嚴(yán)重多器官疾病;合并身體其他部位腫瘤;合并已明確的長(zhǎng)期內(nèi)分泌疾病;術(shù)后病理石蠟切片初篩發(fā)現(xiàn)瘤組織稀少,大片壞死及血凝塊等雜質(zhì)過(guò)多。根據(jù)Knosp分級(jí)[9]進(jìn)一步將研究對(duì)象分為侵襲性PA 37例(Knosp 3級(jí)20例,Knosp 4級(jí)17例),非侵襲性PA 35例。72例患者中,男性34例,女性38例;年齡18～72歲,平均年齡41.53歲;至入院時(shí)病程20 d至8年,平均病程16.24個(gè)月;按激素類型分類,無(wú)功能腺瘤15例,催乳素腺瘤33例,生長(zhǎng)激素腺瘤14例,促甲狀腺激素腺瘤5例,促性腺激素細(xì)胞腺瘤型5例;經(jīng)蝶手術(shù)40例,經(jīng)顱手術(shù)32例。患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)法 收集患者手術(shù)瘤組織(1.0～1.5 cm)及少量瘤旁正常組織。將石蠟包埋的PA組織進(jìn)行4 μm切片,石蠟切片脫蠟和再水合,在乙二胺四乙酸(pH 9.0)中煮沸20 min進(jìn)行抗原修復(fù),避光條件3%過(guò)氧化物酶封閉10 min。將切片與10%山羊血清孵育30 min以阻斷非特異性染色,然后與一抗KAI1/CD82抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)在室溫下孵育60 min。此后在室溫下與二抗一起孵育30 min,使用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色并用蘇木精復(fù)染?？瞻讓?duì)照使用相同體積的PBS緩沖液取代KAI1/CD821抗體。封片后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 結(jié)果判定 KAI1/CD82蛋白表達(dá)水平通過(guò)半定量IHC評(píng)分系統(tǒng)確定,該系統(tǒng)基于陽(yáng)性細(xì)胞百分比和細(xì)胞染色強(qiáng)度的總組合進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分:0分,無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞;1分,不超過(guò)5%陽(yáng)性細(xì)胞;2分,超過(guò)5%且25%以下細(xì)胞染色陽(yáng)性;3分,不少于25%且不超過(guò)50%細(xì)胞染色陽(yáng)性,4分,50%以上細(xì)胞染色陽(yáng)性。染色強(qiáng)度評(píng)分:1分,淡黃色;2分,黃棕色;3分,棕褐色。計(jì)算每個(gè)組織樣本的總分,總分>3分為陽(yáng)性,總分≤3分為陰性。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法 使用Trizol總RNA抽提試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度,使光密度260/光密度280為1.8～2.0,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用qRT-PCR試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)配置25 μl反應(yīng)體系:SYBR Green I qPCR Master Mix 12.5 μl,正反向引物各0.5 μl,cDNA模板2.5 μl,ddH2O 9.0 μl?；靹蚝笤跓晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)儀(美國(guó)ABI公司)中進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)設(shè)置為95℃預(yù)變性2 min,95℃變性15 s,60℃退火20 s,72℃延伸20 s,共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)NCBI相應(yīng)的序列設(shè)計(jì)引物,引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算KAI1/CD82的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 隨訪及預(yù)后 在術(shù)后次日開始隨訪,方式包括電話、短信及門診復(fù)查,周期為6個(gè)月。根據(jù)患者的預(yù)后情況,進(jìn)一步將研究對(duì)象分為預(yù)后良好組(緩解)和預(yù)后不良組(未緩解)。患者預(yù)后未緩解標(biāo)準(zhǔn):隨訪期內(nèi)術(shù)后觀察到新腫塊或磁共振成像診斷剩余腫塊體積增加。

2 結(jié)果

2.1 KAI1/CD82在PA組織、瘤旁組織中的表達(dá)水平 PA組織KAI1/CD82陽(yáng)性率[51.39%(37/72)]低于瘤旁組織[75.00%(54/72)],KAI1/CD82 mRNA表達(dá)低于瘤旁組織[(0.65±0.18)比(1.01±0.32)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 KAI1/CD82在侵襲性、非侵襲性PA組織中的表達(dá)水平 侵襲性PA組織KAI1/CD82陽(yáng)性率[35.14%(13/72)]低于非侵襲性PA組織[65.71%(23/72)],KAI1/CD82 mRNA表達(dá)低于非侵襲性PA組織[(0.46±0.13)比(0.85±0.27)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 影響PA患者預(yù)后的單因素分析 PA患者的預(yù)后情況與瘤卒中、侵犯海綿竇、侵襲性腫瘤、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子、C反應(yīng)蛋白、KAI1/CD82有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 影響PA患者預(yù)后的單因素分析/例(百分率/%)

2.4 Logistic多因素分析 瘤卒中是影響PA患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05);高水平KAI1/CD82是影響PA患者不良預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表3。

表3 Logistic多因素分析

2.5 KAI1/CD82對(duì)PA患者不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 KAI1/CD826水平預(yù)測(cè)PA患者不良預(yù)后的ROC曲線下面積為0.847(95%可信區(qū)間0.743～0.921),靈敏度為96.67%,特異度為66.67%,臨界值為0.630。見圖1。

圖1 瘤組織中KAI1/CD82水平預(yù)測(cè)PA患者不良預(yù)后的ROC曲線

3 討論

PA是常見的顱內(nèi)腫瘤,在總?cè)巳褐械幕疾÷蕿?.1%[10-11]。因高度增殖和侵襲性,侵襲性PA具有浸潤(rùn)周圍關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的傾向,如海綿竇、蝶骨、顱神經(jīng)等,也可能擴(kuò)散到海綿竇或頸內(nèi)動(dòng)脈周圍區(qū)域,很難完全切除[12-13]。手術(shù)治療對(duì)非功能性PA有益,卻無(wú)法完全切除某些腫瘤,因此,治療PA的目的是減輕或消除腫瘤占位病變的影響,糾正腫瘤過(guò)度釋放激素,使垂體維持正常功能[14]。垂體瘤切除手術(shù)復(fù)發(fā)率為7%～35%,且可能導(dǎo)致尿崩癥、蝶骨竇炎、腦脊液滲漏、視力障礙惡化、腦癱、腦膜炎等問(wèn)題[15]。

KAI1/CD82是一種跨膜蛋白,是在各種組織類型中表達(dá)的進(jìn)化保守分子,其首先被確定參與T細(xì)胞活化過(guò)程,現(xiàn)報(bào)道為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因[16]。Al-Khater等[17]認(rèn)為,KAI1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲、誘導(dǎo)細(xì)胞衰老、細(xì)胞間粘附和細(xì)胞凋亡等機(jī)制來(lái)抑制實(shí)體癌的轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn),CD82可通過(guò)阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路,在腎細(xì)胞癌的遷移和侵襲中表現(xiàn)出抑制作用[18]。本研究中:PA組織KAI1/CD82陽(yáng)性率低于瘤旁組織,KAI1/CD82 mRNA表達(dá)低于瘤旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);侵襲性PA組織KAI1/CD82陽(yáng)性率低于非侵襲性PA組織,KAI1/CD82 mRNA表達(dá)低于非侵襲性PA組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示,KAI1/CD82參與且抑制PA的發(fā)生和發(fā)展。Du等[19]發(fā)現(xiàn),KAI1表達(dá)與黑色素瘤、結(jié)直腸癌患者的預(yù)后顯著相關(guān),當(dāng)KAI1表達(dá)水平較低時(shí),患者生存時(shí)間縮短。本研究結(jié)果顯示:高水平KAI1/CD82是影響PA患者不良預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05);KAI1/CD826水平預(yù)測(cè)PA患者不良預(yù)后的ROC曲線下面積為0.847(95%可信區(qū)間0.743～0.921),靈敏度為96.67%,特異度為66.67%,臨界值為0.630。這提示,KAI1/CD826與PA患者的預(yù)后顯著相關(guān),對(duì)PA患者不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值較好。

垂體瘤卒中是一種不常見的綜合征,會(huì)導(dǎo)致垂體腫瘤或腺體自發(fā)性出血或梗死,其最常見于所有類型的垂體偶發(fā)瘤中的非功能性PA,可引發(fā)頭痛、意識(shí)改變,甚至昏迷、死亡[20]。本研究中,瘤卒中是影響PA患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。因此,為提高患者生存率,需對(duì)其進(jìn)行預(yù)防。白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子、C反應(yīng)蛋白是細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)和癌癥進(jìn)展的主要炎癥調(diào)節(jié)因子[21]。炎癥因子受NF-κB信號(hào)通路調(diào)控,而NF-κB在PA中起著重要作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn),PA患者的預(yù)后情況與白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子、C反應(yīng)蛋白有關(guān)(P<0.05)。這提示,不良預(yù)后的PA患者機(jī)體處于高炎狀態(tài)。因此,筆者推測(cè),低水平KAI1/CD82會(huì)加重PA,使患者體內(nèi)炎癥積累,激活NF-κB信號(hào)通路,導(dǎo)致預(yù)后不良。

綜上所述,KAI1/CD82在PA組織中水平降低,其有望成為PA患者不良預(yù)后發(fā)生的預(yù)測(cè)因子。