董彤 韓勇 黃先玫

川崎病（kawasaki disease，KD）又被稱為黏膜皮膚淋巴結綜合征（mucocutaneous lymphnode syndrome，MCLS），是一種好發(fā)于4 個月~5 歲兒童的全身血管炎癥性疾病，男孩較為多見［1-2］。KD 血管炎癥性改變主要發(fā)生于全身的中小動脈，尤其是冠狀動脈，主要表現為擴張、不同大小的冠狀動脈瘤，嚴重時可有心肌缺血、血栓形成、心肌梗死、心包壓塞、冠脈狹窄等，是目前發(fā)達國家獲得性心臟病的主要原因［2］；發(fā)病機制可能是在某種病原體感染后觸發(fā)了川崎病遺傳易感性兒童免疫介導的炎癥級聯(lián)反應［3-4］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）在結構上是一類通過反向剪切形成閉合環(huán)狀結構的單鏈非編碼RNA，其與線性RNA 不同之處是circRNA 缺乏3’和5’端，而直接連接成環(huán)狀結構［5］；circRNA 廣泛分布于人體各個組織和細胞，具有種類豐富，表達穩(wěn)定，高度保守，特異性強的特點［6］。目前研究已發(fā)現circRNA 通過調節(jié)轉錄過程和轉錄后調控，參與了多種疾病的發(fā)病機制，可作為多種疾病潛在診斷和判斷預后的標記物，還可提供治療靶點［7］。本文分析KD 急性期circRNA 與KD 相關實驗室檢查指標的相關性，探討circRNA 對KD 的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019 年2 月至2020 年10 月杭州市第一人民醫(yī)院KD 患兒。納入標準：①均符合AHA2017 年修訂的川崎病診斷標準；②年齡2 個月至6歲；③均為在杭州市第一人民醫(yī)院首次診斷為KD 并完成治療；④病例資料完整；⑤出院后長期隨訪；⑥排除合并有其他自身免疫性疾病或入院前使用過IVIG。同時選取同期因感染性疾?。òl(fā)熱≥5 d，明確有病原體感染或臨床及實驗室檢查數據支持感染者，排除既往有KD 病史及KD 家族史者）和非感染性疾病（包莖、肝功能異常、矮小癥等非感染疾病患兒）患兒為對照組。本研究共納入患兒63 例，KD 組23 例，男12 例，女11 例；年齡（25.04±3.41）個月。感染組20 例，男10例，女10 例，年齡（30.6±3.65）個月。非感染組20例，男12 例，女8 例；年齡（29.85±2.61）個月。三組患兒一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究經本院倫理會批準，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及耗材 （1）試劑：TRIzol（杭州欣耕生物科技有限公司，中國）、氯仿（上海沃凱生物有限公司，中國）、異丙醇（上海沃凱生物有限公司，中國）、75%乙醇（杭州歐拓普生物技術有限公司，中國）、逆轉錄試劑盒（TOYOBO，日本）、RNase R 試劑盒（廣州吉賽生物科技公司，中國）、Real-Time PCR 試劑盒（bimake，美國）、RNase Free 水（QIAGEN，美國）、引物和內參（上海生工生物工程有限公司，中國）。（2）儀器：離心機（Thermo，美國）、渦旋振蕩器（Vortex，美國）、移液槍（Thermo，美國）、恒溫水浴箱（太倉精宏儀器設備有限公司，中國）、逆轉錄儀（BIO-RAD，美國）、NanoDrop 分光光度計（Thermo，美國）、熒光定量PCR 儀（ABI7500，新加坡）。

1.3 方法 （1）查找和篩選目的基因：先在GEO 數據庫（http：//www.NCBI.nlm.nih.gov）檢索與KD 相關的circRNA 表達譜，該數據的登錄號為GSE64486；然后在CircBase 數據庫（www.circbase.org）查找circRNA 的基因來源和序列信息。（2）收集標本：使用EDTA 抗凝管收集三組晨起空腹1.5~2.0 mL 外周靜脈血。（3）分離血漿：將收集的靜脈血離心，離心條件為4℃，3,000 r/min，離心10 min，離心結束后用移液槍吸取上清液即血漿分裝在無RNA 酶EP 管內。（4）提取RNA ：使用TRIzol 法提取血漿中的總RNA，提取后使用NanoDrop 分光光度計對血漿總RNA 的濃度和純度進行測量。（5）RNA 逆轉錄：先按RNase R 試劑盒說明書步驟去除血漿中的線性RNA，再將去除線性RNA 的血漿總RNA 按照TOYOBO qPCR RT 逆轉錄試劑盒說明書的要求在逆轉錄儀器上操作逆轉錄合成cDNA。（6）實時熒光定量PCR：將逆轉錄的cDNA 按照bimake 2xSYBR Green qPCR Master mix 試劑盒說明書步驟在ABI7500 儀器上進行實時熒光定量PCR 操作。目的基因circRNA 基因序列在circBase 進行查找，查找后按照circRNA 引物設計原則進行設計，由上海生工公司對引物進行合成。見表1。（7）qRT-PCR結果分析：circRNA 的相對定量采用2-△△Ct法進行分析，以GAPDH 作為內參照；其中，?Ct=Ct（目的基因）-Ct［內參基因（GAPDH）］，△△Ct=實驗組△Ct- 對照組△Ct，再取各組2-△△Ct即為相對表達量，?Ct 值越大，提示circRNA 表達水平越低。

表1 circRNA引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0軟件。符合正態(tài)分布計量資料以（±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多樣本平均數間的比較采用單因素方差分析；偏態(tài)分布計量資料以中位數［M（Q1，Q3）］表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskcal-Wailsh 檢驗；計數資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者操作特征曲線（ROC）和ROC 曲線下面積（AUC）評估circRNA 在KD中的診斷價值。

2 結果

2.1 血漿circRNA 在KD 組、感染組及非感染組中的表達情況 KD 組患兒血漿中hsa_circ_0094885 表達水平低于感染及非感染組（P<0.05）；血漿hsa_circ_0017348 表達水平在KD 組高于感染及非感染組（P<0.05）；KD 組血漿hsa_circ_0003609 低于非感染組（P<0.05）。見圖1。

圖1 三組患兒血漿circRNA的表達情況

2.2 血漿circRNA 在KD 急性期與恢復期中的表達情況 血 漿hsa_circ_0094885、hsa_circ_001640 和hsa_circ_0003609 在KD 急性期中表達水平均低于恢復期（P<0.05）。見圖2。

圖2 兩組患兒血漿circRNA的表達情況

2.3 血漿circRNA 在各組中表達水平比較 KD 組血漿hsa_circ_0094885 表達水平低于感染組及非感染組（P<0.05）；KD 組血漿hsa_circ_0017348 表達水平高于感染組及非感染組（P<0.05）。見表2。KD 急性期血漿hsa_circ_0094885 表達水平低于恢復期表達水平（P<0.05）。見表3。

表2 三組血漿hsa_circ_0094885及hsa_circ_0017348表達水平比較（±s）

表2 三組血漿hsa_circ_0094885及hsa_circ_0017348表達水平比較（±s）

注：與感染組比較，*P<0.05；與非感染組比較，#P<0.05

指標 感染組（n=20）非感染組（n=20）KD 組（n=23） H 值 P 值hsa_circ_0094885 1.41±0.18 1.40±0.20 0.51±0.19*# 26.438 <0.001 hsa_circ_0017348 2.94±0.41 0.39±0.03 10.29±2.90*# 8.974 <0.05

表3 KD急性期與恢復期血漿hsa_circ_0094885表達水平比較（±s）

表3 KD急性期與恢復期血漿hsa_circ_0094885表達水平比較（±s）

時間急性期恢復期t 值P 值hsa_circ_00948850.43±0.03 2.02±0.90-2.38<0.05

2.4 hsa_circ_0094885 在KD 中潛在診斷價值 采用ROC 曲線評估血漿hsa_circ_0094885 的診斷效能，結果顯示：血漿hsa_circ_0094885 的ROC 曲線下面積為0.763，標準誤0.072，95%置信區(qū)間0.621~0.905，截斷值是0.46，敏感度為78.26%，特異度為78.57%。見圖3。

圖3 血漿hsa_circ_0094885對KD的ROC分析

3 討論

KD 的診斷主要依靠KD 特征性臨床表現、一般實驗室檢查及心臟超聲檢查［8］。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，越來越多的非編碼RNA 可能參與KD 的發(fā)病以及可作為KD 的診斷標志物。circRNA 作為近幾年來的熱點之一，被越來越多的學者發(fā)現其與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關性［9-12］。在心血管疾病中既往研究發(fā)現外周血中hsa_circ_0082081 與hsa_circ_0124644可能是冠狀動脈疾病的診斷標志物，尤其是兩者結合起來診斷效能更高［13］。此外，急性期KD 患兒血清circ_ANRIL 表達水平與健康對照組相比明顯上調，經IVIG治療后明顯下降［14］。

本研究顯示，KD 組急性期血漿hsa_circ_0094885表達水平低于感染組及非感染組（P<0.05），經過治療后KD 患兒恢復期血漿hsa_circ_0094885 水平上調，提示hsa_circ_0094885 可能與KD 的發(fā)生相關；KD 患兒急性期血漿hsa_circ_0017348表達水平高于感染組及非感染組（P<0.05），經治療后KD 患兒恢復期hsa_circ_0017348表達水平無明顯變化，因此hsa_circ_0017348 與KD 是否具有相關性不明確；血漿hsa_circ_0003609 和hsa_circ_001640 在三組中表達水平差異無無統(tǒng)計學意義，因此hsa_circ_0003609 和hsa_circ_001640 可能與KD 發(fā)生無關。

以往研究發(fā)現，hsa_circ_0094885 為circ_ATM，其基因位點在chr11：108098332-108100050，ATM 主要在DNA 修復和細胞周期調節(jié)中發(fā)揮重要作用，其編碼的蛋白屬于PI3/PI4 激酶家族，是多種下游蛋白包括P53、BRCA1、CHK2、RAD17 等的調節(jié)因子，此外，ATM 已經被證明其發(fā)生突變可導致共濟失調毛細血管擴張［15］，然而也有較多研究證明ATM 基因多態(tài)性與肺癌、放射性肺炎、乳腺癌等有關［16］，可作為這些疾病的早期預測因子。通過ROC 曲線對血hsa_circ_0094885 的診斷效能進行評估，結果顯示AUC 為0.763，敏感度為78.26%，特異度為78.57%，表明血漿hsa_circ_0094885在KD 診斷中具有較高的敏感度和特異度，進一步提示hsa_circ_0094885 有望成為診斷KD 的新型生物學標志物。