王希 馮丹丹 潘思旭 邢茜 夏國(guó)蓮 江榮林

膿毒癥為臨床常見(jiàn)的危重病癥，是人體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)而致危及生命的器官功能障礙，具有較高的發(fā)生率和死亡率［1］。腸屏障功能與膿毒癥密切相關(guān)［2］，腸屏障包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障，正常生理狀態(tài)下腸屏障能保護(hù)機(jī)體免受腸內(nèi)微生物及外界病原體的入侵，維持機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)［3］。然而在膿毒癥的病理狀態(tài)下，腸屏障結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，腸道內(nèi)的細(xì)菌和毒素突破屏障進(jìn)入其他器官或血液，刺激炎癥因子釋放，影響胞間緊密連接蛋白的表達(dá)，改變腸上皮細(xì)胞通透性，加重患者病情，甚至出現(xiàn)多器官衰竭［4-5］，因此，通過(guò)保護(hù)腸屏障功能治療膿毒癥具有重要的臨床意義。丹參酮IIA 具有抗氧化、抗炎等作用，目前用于治療心血管疾病、腎缺血再灌注損傷、肝病等［6-8］，同時(shí)丹參酮IIA 還能通過(guò)發(fā)揮抗炎作用保護(hù)膿毒癥小鼠神經(jīng)損傷［9］，緩解膿毒癥小鼠急性肺損傷［10］。本研究采用LPS 誘導(dǎo)人腸上皮細(xì)胞株Caco2 構(gòu)建膿毒癥細(xì)胞模型，檢測(cè)丹參酮IIA 對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1 及炎癥因子IL-17A、IL-17C 的影響，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）蛋白的表達(dá)水平及磷酸化程度，闡明丹參酮IIA 對(duì)膿毒癥模型緊密連接蛋白的作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株Caco2，購(gòu)于武漢普諾賽。Caco2 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2，待其生長(zhǎng)密度為80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2 主要試劑 丹參酮IIA（Solarbio，北京，ST8020），脂多糖（LPS）（SIGMA，美國(guó)，L2880），DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO，美國(guó)，11995065），胎牛血清（FBS）（GIBCO，美 國(guó)，10270106），Trizol（Invitrogen， 美 國(guó)，1596-026），F(xiàn)ITC-右旋糖酐（SIGMA，美國(guó)，53379），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，加拿大，K1622），SYBR Green PCR 試劑盒（Thermo，美國(guó)，K0223），引物均由上海生工生物工程有限公司合成。ZO-1 抗體、Occludin 抗體、Claudin-3 抗體、ERK 抗體、p-ERK 抗體、JAM 抗體均購(gòu)自Affinity Biosciences（親科，江蘇），GAPDH 抗體（Abcam，英國(guó)，ab37168），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（碧云天，江蘇，A0208）。

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO，MCO-15AC），酶標(biāo)儀（Thermo，MULTISKAN MK3），熒光定量PCR 儀（ABI 公司，ABI-7300），垂直電泳儀（Bio-Rad，014BR），倒置顯微鏡（Carl Zeiss，Axio Vert.A1），臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（Eppendorf，5430R），凝膠成像儀（Bio-Rad，ChemiDoc XRS+System）。

1.4 通透性檢測(cè) 在Transwell 上室加入80 μL Matrigel（4 μg/uL），37 ℃ 放置30 min 使其聚合成凝膠。調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL，取200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 上室，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，在上室中加入FITC 標(biāo)記的葡聚糖和不同濃度LPS，下室加入500 μL含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液。于LPS 處理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h 后，吸取下室100 μL 液體到96 孔板中，測(cè)量FITC 的OD 值，計(jì)算各組細(xì)胞的通透率。

1.5 Western Blot 檢測(cè) 收集各處理組細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后加入RIPA 裂解液，充分裂解后收集裂解液，12,000 r/min 離心15 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。配制10%濃度的分離膠和5%濃度的濃縮膠，以蛋白上樣量為20μg/孔進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后采用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，孵育一抗ZO-1，Occludin，Claudin-3，ERK，p-ERK，JAM，4℃搖床震蕩孵育過(guò)夜。TBST 洗膜3 次，10 min/次，隨后室溫孵育二抗1 h，經(jīng)TBST洗膜3 次后，ECL 發(fā)光液顯影，凝膠成像儀進(jìn)行曝光。

1.6 RT-PCR 檢測(cè) 采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后用SYBR Green PCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，IL-17A 上游引物（5’-TGTGATCTGGGAGGCAAAGT-3’），IL-17A 下游引物（5’-CCCACGGACACCAGTATCTT-3’），IL-17C上游引物（5’-GACCGCTATCCACAGAAGCT-3’），IL-17C 下游引物（5’-GACGTGGATGAACTCGGTGT-3’），反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞構(gòu)建膿毒癥腸屏障損傷模型 腸上皮細(xì)胞Caco 2 經(jīng)100 μg/mL LPS 處理后，分別在不同時(shí)間段檢測(cè)細(xì)胞通透性，結(jié)果顯示，經(jīng)LPS 處理3 h 后Caco2 細(xì)胞通透率較對(duì)照組顯著上升（P<0.01），見(jiàn)圖1。其在3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 及72 h 的通透率分別為208.58%、280.99%、393.15%、535.63%、817.27%、1062.63%。不同濃度0、0.1、1、10、50、100 及200μg/mL 的LPS 處理Caco2 細(xì)胞3 h 后，檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 及Claudin-1 表達(dá)水平，結(jié)果顯示0、0.1、1、10、50 μg/mL 的LPS 對(duì)ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表達(dá)水平無(wú)影響（P>0.05），而100、200 μg/mL 的LPS 能顯著抑制ZO-1、Occludin及Claudin-1 的表達(dá)（P<0.05）。見(jiàn)圖2。Caco2 細(xì)胞經(jīng)100 μg/mL LPS 處理不同時(shí)間后，其緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表達(dá)水平在1 h 內(nèi)無(wú)顯著變化（P>0.05），在3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h均顯著下降，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈依賴性下降。因此，本研究采用100μg/mL LPS 處理3 h 構(gòu)建膿毒癥腸屏障功能障礙細(xì)胞模型。

圖1 LPS在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Caco2細(xì)胞緊密連接蛋白的影響

圖2 不同濃度LPS影響Caco2細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)

2.2 丹參酮IIA 對(duì)腸黏膜緊密連接蛋白的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組中LPS 能顯著抑制Caco2 細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)（P<0.05），經(jīng)0.14、0.68、3.4 μmol/L 的丹參酮IIA 處理后，ZO-1、Occludin 及Claudin-1 蛋白表達(dá)水平較LPS 組均上升（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度TAN IIA對(duì)LPS處理后的Caco2細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

2.3 丹參酮IIA對(duì)Caco2炎癥因子的影響 與正常對(duì)照組相比，LPS 能顯著升高Caco2 細(xì)胞炎癥因子IL-17A 及IL-17C mRNA的水平（P<0.01），而經(jīng)丹參酮IIA處理后，IL-17A 及IL-17C mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 LPS及丹參酮IIA處理對(duì)Caco-2細(xì)胞中IL-17A和IL-17C表達(dá)的影響

2.4 丹參酮IIA 通過(guò)p-ERK 調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，LPS 組、丹參酮IIA組、LPS+SLIGRL-NH2 組、LPS+TBHQ 組、 丹 參 酮IIA+SLIGRL-NH2 組及丹參酮IIA+TBHQ 組ERK 蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化，而p-ERK 即ERK 的磷酸化水平有變化。LPS 處理后，Caco2 細(xì)胞的ERK 磷酸化水平顯著上升（P<0.01），丹參酮IIA 能顯著抑制該過(guò)程，加入ERK 激動(dòng)劑TBHQ 或PAR2 激動(dòng)劑SLIGRL-NH2 可以抑制丹參酮IIA對(duì)Caco2細(xì)胞ERK磷酸化水平的下調(diào)作用，見(jiàn)圖5。LPS 可下調(diào)Caco2 中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 及JAM 蛋白表達(dá)水平，而丹參酮IIA 處理可使緊密連接蛋白的表達(dá)水平恢復(fù)，ERK 激動(dòng)劑TBHQ 或PAR2 激動(dòng)劑SLIGRL-NH2 則可抑制丹參酮IIA 對(duì)LPS誘導(dǎo)下Caco2 細(xì)胞中ZO-1、Occludin 及JAM 蛋白表達(dá)的恢復(fù)作用，見(jiàn)圖6。

圖5 TAN IIA 處理對(duì)LPS誘導(dǎo)下ERK信號(hào)通路的影響

圖6 丹參酮IIA 對(duì)LPS誘導(dǎo)下Caco2細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)影響

3 討論

膿毒癥與腸屏障功能障礙密切相關(guān)，膿毒癥不僅引起細(xì)胞凋亡、壞死，同時(shí)感染促進(jìn)機(jī)體釋放大量炎癥因子，損傷黏膜上皮，增加腸屏障通透性［11］，從而加速膿毒癥進(jìn)展，最終導(dǎo)致多器官衰竭。目前關(guān)于膿毒癥的治療方法不斷發(fā)展，但嚴(yán)重膿毒癥患者的死亡率仍然居高不下。丹參酮IIA 具有抗氧化、抗炎、抗凝血、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)免疫等功能［12］，在緩解膿毒癥腸屏障功能障礙方面具有巨大潛力。

腸上皮細(xì)胞和胞間緊密連接蛋白形成機(jī)械屏障，腸上皮細(xì)胞主要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡［13］，胞間緊密連接蛋白包括ZOs、Occludin、Claudin-1和JAMs［14］，連接填充腸上皮細(xì)胞間的縫隙，因此緊密連接蛋白表達(dá)異常將影響腸黏膜通透性。

大量文獻(xiàn)報(bào)道，在膿毒癥腸屏障功能障礙動(dòng)物模型中，緊密連接蛋白ZO-1 及Occludin 的表達(dá)水平下降，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，導(dǎo)致腸屏障通透性增大，而改善緊密連接蛋白表達(dá)則能有效緩解腸屏障功能障礙［15-16］，研究者在結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)增加ZO-1 和Occludin 的表達(dá)，能調(diào)節(jié)腸屏障通透性，修復(fù)腸屏障功能［17］，同時(shí)，任何感染或嚴(yán)重創(chuàng)傷等引起腸道屏障穩(wěn)態(tài)改變，進(jìn)而破壞腸道緊密連接蛋白，增加上皮細(xì)胞通透性［18-19］，均提示緊密連接蛋白的表達(dá)與腸屏障功能密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Caco2 細(xì)胞經(jīng)100 μg/mL LPS 處理3 h 后，細(xì)胞通透性上升，同時(shí)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1 表達(dá)下降，成功構(gòu)建膿毒癥腸屏障功能障礙細(xì)胞模型。經(jīng)丹參酮IIA 治療后，ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表達(dá)水平較模型組上升，IL-17A 及IL-17C mRNA 的表達(dá)水平下降，表明丹參酮IIA 能修復(fù)LPS 導(dǎo)致的緊密連接蛋白下調(diào)，降低炎癥反應(yīng)，緩解膿毒癥腸屏障功能障礙。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）在細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，參與炎癥、細(xì)胞凋亡等過(guò)程，是維持胃腸道穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)腸屏障功能的重要途徑之一。研究表明，在內(nèi)臟高敏大鼠模型中，激活PAR2/ERK 信號(hào)通路，引起ZO-1、Occludin 表達(dá)下降，導(dǎo)致腸屏障功能受損［20］。在結(jié)腸炎大鼠模型中，激活ERK 信號(hào)通路升高炎癥水平，緊密連接蛋白表達(dá)下降，抑制ERK 蛋白磷酸化則能降低結(jié)腸組織中的炎癥水平［21］。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 能誘導(dǎo)Caco2 細(xì)胞中p-ERK 水平升高，丹參酮IIA 治療則能降低p-ERK 水平。在丹參酮IIA 治療組加入ERK 激動(dòng)劑TBHQ，結(jié)果顯示與丹參酮IIA 治療組相比，TBHQ 能升高p-ERK 水平，并降低緊密連接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1 的表達(dá)。

綜上所述，丹參酮IIA 可能通過(guò)抑制ERK 蛋白磷酸化水平，上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，緩解腸屏障功能障礙，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。