鄭洋濱，洪燕，龔瑋，周年，劉寧

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

夏枯草主要有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血壓等藥理作用［1］，具有清火除熱，清肝明目，散結(jié)消腫等功效［2］，可有效擴(kuò)張血管，具有良好的降壓效果［3］。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，夏枯草乙酸乙酯提取物有內(nèi)皮依賴性血管舒張作用，且其血管舒張作用與一氧化氮（NO）的釋放和一氧化氮合酶（NOS）的調(diào)節(jié)有關(guān)［4］。夏枯草乙酸乙酯提取物多為揮發(fā)油、萜類、黃酮、甾醇類和香豆素類。已有文獻(xiàn)［5-6］報(bào)道夏枯草中的黃酮類化合物主要有山柰酚、槲皮素、蘆丁等，均是有明確舒張血管作用的化合物，均能導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性大鼠胸主動(dòng)脈舒張。為了進(jìn)一步闡明夏枯草乙酸乙酯提取物的降壓機(jī)制，本課題組對(duì)其在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用機(jī)制進(jìn)行更深入研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞融合細(xì)胞（EA·hy926），購(gòu)自上海語純生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品及主要試劑

夏枯草藥材購(gòu)自毫州市中信中藥飲片廠，批號(hào)：1 904001；人內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）測(cè)定劑盒（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：F0465-B）；NO 測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：NOS0021S）；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：NO.P0012S）；兔抗人窖蛋白-1（Cav-1）多克隆抗體（批號(hào)：0209500101），兔抗人內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）多克隆抗體（批號(hào)：5500004931），兔抗人磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）多克隆抗體（批號(hào)：2101760101），兔抗人熱激蛋白90（HSP-90）多克隆抗體（批號(hào)：4000001169）均購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；小鼠抗人β-action（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號(hào)：#37u8343），辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（批號(hào)：22221），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號(hào)：20121）均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

MB614S 電子天平（d=0.1mg），PowerPacTM Basic電泳儀，IC1000 細(xì)胞計(jì)數(shù)器，ChemiDoc MP 凝膠成像儀，MULTISKAN GO 酶標(biāo)儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)樣品配制 稱取夏枯草乙酸乙酯干浸膏2.03 g 加二甲基亞砜（DMSO）10 mL 溶解為母液。用DMEM 培養(yǎng)基將母液稀釋至1 500.00、1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.20、15.60 μg/mL的樣品。

1.4.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板。待細(xì)胞鋪滿80%，加入“1.4.1”項(xiàng)下樣品，空白對(duì)照組給予5‰DMSO的培養(yǎng)基，每組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔。24 h 后每孔加入MTT 20 μL，CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去孔內(nèi)液體，每孔加DMSO150 μL 溶解，振蕩10 min，在570 nm和630 nm 雙波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。計(jì)算相對(duì)增殖度（RGR），RGR=實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照組吸光度×100%。RGR ≥80%則認(rèn)為無細(xì)胞毒性作用［7］。

1.4.3 對(duì)NO 濃度和NOS 含量的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板。待細(xì)胞鋪滿80%，加入31.20、15.60、7.80 μg/mL 的樣品作為高、中、低劑量組，陰性對(duì)照組給予5‰DMSO的培養(yǎng)基。24 h 后收集上清液，檢測(cè)細(xì)胞外NO 含量，每組重復(fù)測(cè)定8 次。將6 孔板置于冰上，每孔加4 ℃預(yù)冷PBS 洗滌3 次，再加200 μL 細(xì)胞裂解液，用槍吹打數(shù)下，將裂解液和細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，14 000 g 離心5 min，離心半徑7 cm。取上清液檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO 和eNOS 含量，每組重復(fù)測(cè)定8 次。

1.4.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) BCA 蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)含量，取等量蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，而后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，封閉液孵育1 h 后，根據(jù)marker 標(biāo)記剪取目的蛋白eNOS、p-eNOS、HSP-90 和Cav-1 的條帶，分別加入經(jīng)1∶500 稀釋后的兔抗人eNOS、p-eNOS、HSP-90、Cav-1 多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜后用1∶2 000 稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 在脫色搖床上室溫孵育1 h。孵育后的PVDF 膜經(jīng)3 次洗滌，加入顯色劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，采用Image J 軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行灰度分析［8］，重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)夏枯草乙酸乙酯提取物濃度大于31.20 μg/mL 時(shí)，會(huì)影響EA·hy926 的增殖度，見圖1。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇31.20、15.60、7.80 μg/mL作為高、中、低劑量組。

圖1 夏枯草乙酸乙酯提取物MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 對(duì)NO 釋放量及eNOS 含量的影響

中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)NO 和eNOS 含量高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。高、中、低三個(gè)劑量組對(duì)細(xì)胞外NO 含量均無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 夏枯草乙酸乙酯提取物對(duì)NO釋放量及eNOS含量的影響（，n=8）

表1 夏枯草乙酸乙酯提取物對(duì)NO釋放量及eNOS含量的影響（，n=8）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP＜0.05；eNOS，內(nèi)皮型一氧化氮合酶；NO，一氧化氮。

2.3 對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)eNOS 和HSP-90 的蛋白表達(dá)均高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），Cav-1 的蛋白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。高劑量組p-eNOS 蛋白表達(dá)高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見表2、圖2。

表2 夏枯草乙酸乙酯提取物對(duì)eNOS、p-eNOS、Cav-1和HSP-90蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

表2 夏枯草乙酸乙酯提取物對(duì)eNOS、p-eNOS、Cav-1和HSP-90蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

注：表格數(shù)據(jù)為各蛋白灰度值，以β-actin為對(duì)照；與陰性對(duì)照組比較，aP＜0.05；eNOS，內(nèi)皮型一氧化氮合酶；p-eNOS，磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶；Cav-1，窖蛋白-1；HSP-90，熱激蛋白90。

圖2 夏枯草乙酸乙酯提取物對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

Cav-1 是胞膜窖的膜整合蛋白，主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中，負(fù)責(zé)調(diào)控眾多定位于胞膜窖的信號(hào)分子的活性。在靜息狀態(tài)下，eNOS與Cav-1 結(jié)合，處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受外界信號(hào)刺激時(shí)，eNOS 與Cav-1 分離，eNOS 被激活，從而產(chǎn)生NO［9-12］。HSP-90 作為分子伴侶蛋白，細(xì)胞受外界信號(hào)刺激時(shí)，HSP-90 會(huì)占據(jù)eNOS 上的Cav-1結(jié)合位點(diǎn)，eNOS 與HSP-90 的結(jié)合促進(jìn)了Akt 的聚集，Akt 使eNOS 的Ser1179 和Thr497 磷酸化，促進(jìn)eNOS 釋放NO，舒張血管，降低血壓。因此，降低Cav-1 表達(dá)，增加HSP-90 表達(dá)，可以促進(jìn)eNOS 釋放NO［13-15］。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，夏枯草乙酸乙酯提取物能增加細(xì)胞內(nèi)eNOS 含量，促進(jìn)NO 釋放，其通過提高EA·hy926 內(nèi)eNOS 和p-eNOS 的蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)eNOS 的含量和活性，使NO 釋放增多。此外夏枯草乙酸乙酯提取物還能增加HSP-90 的蛋白表達(dá)，降低Cav-1 的蛋白表達(dá)，使eNOS 與HSP-90 結(jié)合增多，促進(jìn)eNOS 磷酸化，增加NO 的釋放。然而，本次實(shí)驗(yàn)未對(duì)夏枯草乙酸乙酯提取物進(jìn)行進(jìn)一步的分離、純化；因此，夏枯草提取物中具體哪一類化合物起到增加NO 釋放作用將是課題組未來的研究方向。

綜上所述，夏枯草乙酸乙酯提取物的舒張血管作用與增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO 釋放有關(guān)，其能夠通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS、p-eNOS 和HSP-90 的蛋白表達(dá)，降低Cav-1 的蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)eNOS 的含量和活性，促進(jìn)eNOS 釋放NO，從而舒張血管，降低血壓。本次實(shí)驗(yàn)基本闡明了夏枯草乙酸乙酯提取物在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用機(jī)制，為夏枯草進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。