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        金魚體內(nèi)吡蟲啉及其代謝產(chǎn)物的檢測方法

        2023-08-29 00:53:58徐王暉侯佳音周忠靜俞建忠章陸陸杜曉華陳列忠
        現(xiàn)代農(nóng)藥 2023年4期

        徐王暉,侯佳音,周忠靜,俞建忠,章陸陸,3,杜曉華,陳列忠*

        (1. 浙江工業(yè)大學化學工程學院,杭州 310014;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室,杭州 310021;3.寧波大學食品與藥學學院,浙江寧波 315832)

        吡蟲啉(Imidacloprid),分子式為C9H10ClN5O2,化學名稱為(E)-1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺,結(jié)構(gòu)式見圖1,是第一代新煙堿類殺蟲劑,自1991年投放市場以來,已在120多個國家登記使用[1]。由于使用量大,使用范圍廣,又具有較好的水溶性和環(huán)境穩(wěn)定性,吡蟲啉已在世界各地的水體中形成了較為普遍的殘留污染[2-3],對環(huán)境和環(huán)境生物存在潛在的危害風險。已有研究表明,吡蟲啉會影響非靶標生物的健康狀態(tài),如:會引發(fā)斑馬魚腸道組織的損傷和氧化應激,輕微誘發(fā)腸道菌群失調(diào)和特定細菌改變[4];誘導雄性小鼠產(chǎn)生氧化應激[5];具有肝毒性,并導致大鼠雄性生殖系統(tǒng)受損[6-7]。

        圖1 吡蟲啉結(jié)構(gòu)式

        目前,國內(nèi)外關(guān)于吡蟲啉在哺乳動物、植物以及昆蟲中的代謝產(chǎn)物已有較多報道,常見代謝產(chǎn)物有5-羥基吡蟲啉、4,5-二羥基吡蟲啉、烯式吡蟲啉、吡蟲啉亞硝基亞胺、吡蟲啉脲、6-氯煙酸等(表1),在不同生物體內(nèi)的代謝途徑主要有反硝化作用、硝基還原、氧化、水解等(圖2)。但是關(guān)于吡蟲啉在水生生物中代謝的研究仍較少。而魚類作為水生生物中重要的一環(huán),在研究吡蟲啉在生物體中的代謝時,理應受到關(guān)注。金魚(Carassius auratus)屬于鯉科鯽屬魚類,是一種中國特色的水生生物,故本文選用金魚作為研究生物,更能體現(xiàn)吡蟲啉對水生生物的影響。

        表1 吡蟲啉在生物體內(nèi)的常見代謝物

        圖2 生物體內(nèi)吡蟲啉的降解途徑[1]

        本研究以金魚作為研究對象,采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定了吡蟲啉在金魚體內(nèi)主要的代謝產(chǎn)物,探究吡蟲啉及代謝物含量的定量測定方法,可為后續(xù)進一步進行吡蟲啉對金魚的毒理學評估提供技術(shù)支持。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        儀器:SCIEX 5500+高效液相三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國愛博才思公司;Eclipse C18柱,美國安捷倫公司;Sartorius BSA124S萬分之一天平,德國賽多利斯公司;LC-DCY-12SF水浴氮吹儀,上海力辰儀器科技有限公司。

        試劑:吡蟲啉(純度95%),上海源葉生物科技有限公司;吡蟲啉標準品(純度98%),上海安譜實驗科技股份有限公司;100 mg/L吡蟲啉脲-甲醇標準溶液、100 mg/L烯式吡蟲啉-甲醇標準溶液、100 mg/L 5-羥基吡蟲啉-甲醇標準溶液、100 mg/L 6-氯煙酸-甲醇標準溶液,天津阿爾塔科技有限公司;甲醇(色譜級)、乙酸乙酯(色譜級),美國密理博公司;純凈水,屈臣氏有限公司。

        1.2 試驗材料與處理

        金魚(Carassius auratus)成魚,購自杭州市鳳起花鳥市場。所有金魚在正式試驗前均在實驗室馴養(yǎng)1周以上。馴養(yǎng)條件如下:試驗用水為曝氣除氯的自來水,pH為7.0~8.5,溫度為(20.9±0.4)℃,溶解氧為6.9±0.2 mg/L,養(yǎng)殖用水符合GB11607—1989《漁業(yè)水質(zhì)標準》[13]的規(guī)定。在正式處理開始前,按1.5中的檢測條件對馴化后的金魚進行隨機檢測,結(jié)果為其體內(nèi)沒有吡蟲啉及其代謝物的存在。

        金魚處理:馴化后的金魚隨機分成對照組和兩個吡蟲啉處理組,根據(jù)吡蟲啉對金魚的安全濃度,設置處理濃度分別為20 mg/L和40 mg/L[14]。暴露時間為28 d,在每一試驗組隨機放入60尾金魚,養(yǎng)殖密度為4尾/L。在試驗開始前以及暴露2 h、6 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和28 d從各試驗組隨機取出5條魚,解剖,取每條金魚肝臟、腸道、肌肉、鰓組織、腦組織和性腺于EP管中,樣品保存于-80℃冰箱中,待分析。

        1.3 樣品前處理

        取金魚組織樣本置于20 mL離心管中,然后加入適量乙酸乙酯溶液,渦旋混勻1 min,再加入1 g無水MgSO4和0.5 g硅藻土,渦旋混勻1 min后在室溫下超聲10 min,之后以4 000 r/min在4℃下離心10 min,取上層清液,氮吹至干,以甲醇定容至1 mL后過膜分析。

        1.4 標準溶液的制備

        用分析天平準確稱取吡蟲啉標準品0.010 0 g,將稱好的樣品放置在100 mL容量瓶中,以甲醇為溶劑,并用超聲使樣品溶解完全,定容至刻度線,配制成100 mg/L的儲備液。分別移取吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉和6-氯煙酸的標準溶液各100 μL至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成1 μg/L的混標溶液,避光保存于-20℃冰箱中備用。

        1.5 色譜質(zhì)譜條件

        1.5.1 液相色譜條件

        液相色譜柱:Eclipse C18柱(1.8 μm,3.0 mm×100 mm);柱溫:40℃;進樣體積:2 μL;流速:5 μL/s;流動相:水相為0.1%甲酸水,有機相為甲醇,采用梯度洗脫,洗脫程序如表2。

        表2 液相色譜檢測吡蟲啉及代謝物梯度洗脫程序

        1.5.2 質(zhì)譜條件

        質(zhì)譜離子源:電噴霧離子源ESI;離子化模式:正離子模式;掃描方式:選擇離子反應監(jiān)測模式(SRM);噴霧電壓:4 000 V;溫度:200℃;鞘氣和輔助氣均為高純氮氣,壓力均為413.7 kPa;離子傳輸毛細管溫度:450℃。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 金魚體內(nèi)吡蟲啉代謝物的定性分析

        取吡蟲啉處理后的金魚組織樣本進行液質(zhì)分析。選擇全離子掃描模式對m/z 50~1 000范圍內(nèi)的離子對進行全掃描。對比吡蟲啉代謝物的質(zhì)譜標準譜庫信息可知,質(zhì)荷比在256.2、212.2、254.2、223.1、171、155.9、128.1、112.1范圍左右存在重合,故推測出吡蟲啉在金魚體內(nèi)可能代謝成吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉和6-氯煙酸,其離子碎片信息(表3)和液相色譜圖如圖3所示。

        表3 吡蟲啉及其代謝物離子碎片信息

        圖3 吡蟲啉及其代謝物液相色譜圖

        2.2 前處理條件的優(yōu)化

        分別選擇2∶1、1∶1、1∶2不同比例的乙酸乙酯-水混合溶液以及9、12 mL和18 mL不同用量的乙酸乙酯-水混合溶液,考察其在金魚組織樣品中對吡蟲啉及其代謝物的提取效率,結(jié)果如圖4~5所示。檢測結(jié)果顯示,當乙酸乙酯∶水比例為2∶1,用量為12 mL時,對金魚組織中吡蟲啉及其代謝物回收率最高。

        圖4 不同比例的乙酸乙酯-水混合溶液對金魚組織中吡蟲啉及其代謝物的提取效果

        圖5 不同用量的乙酸乙酯-水混合溶液對金魚組織中的吡蟲啉及其代謝物的提取效果

        2.3 方法學考察

        2.3.1 方法的線性關(guān)系

        在0.1~100 μg/L質(zhì)量濃度標準曲線范圍內(nèi),吡蟲啉及其代謝物峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.99,線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表4。

        表4 吡蟲啉及其代謝物標準曲線的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

        2.3.2 方法的檢測限和定量限

        向空白處理的組織樣本中添加待測的組分,按“信噪比”法,測定信噪比為3∶1時,添加的化合物的量為方法的檢出濃度;測定信噪比為10∶1時,添加的化合物的量為方法的最低定量濃度。測得吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸的檢測限分別為0.001、0.009 9、0.001 1、0.006 8 μg/L和0.005 6 μg/L,定量限分別為0.003 34、0.032 907、0.003 519、0.022 718 μg/L和0.018 682 μg/L。

        2.3.3 方法精密度

        在選定的分析條件下,對同一個吡蟲啉及其代謝物混標溶液(10 μg/L)平行測定5次,計算吡蟲啉及其代謝物的標準偏差和相對標準偏差。由表5可知,吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸的標準偏差分別為0.369 3、0.215 2、0.396 8、0.298 8和0.265 6,相對標準偏差分別為3.41%、1.98%、3.79%、2.84%和2.64%。所有相對標準偏差均小于4%,則該方法的重現(xiàn)性好、精密度高。

        表5 吡蟲啉及其代謝物的精密度試驗結(jié)果

        2.3.4 方法準確度

        取空白處理的金魚組織樣本,在其中添加待測的組分,按優(yōu)化后的前處理方法進行處理,按照選定的色譜條件測定樣品中的吡蟲啉及其代謝物的含量,計算平均回收率。吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸的平均回收率分別為96.08%,99.77%,85.25%,87.24%和100.23%(表6),表明該方法的準確度滿足農(nóng)藥殘留測定的要求。

        表6 吡蟲啉及其代謝物的添加回收率

        2.4 樣品檢測

        染毒濃度依據(jù)吡蟲啉對鯽魚的CL50設置[14],分別用20 mg/L和40 mg/L的吡蟲啉染毒,28 d后取金魚的組織樣本。按照優(yōu)化后的提取方法進行提取,再進行LC/MS分析。結(jié)果測得金魚體內(nèi)吡蟲啉的含量在1 000~6 500 ng/g之間,20 mg/L吡蟲啉處理中殘留量最高的組織是腸道。吡蟲啉的主要代謝產(chǎn)物是吡蟲啉脲和5-羥基吡蟲啉,體內(nèi)殘留量分別為50~400 ng/g和30~300 ng/g;少量代謝成6-氯煙酸和烯式吡蟲啉,含量分別為0.2~2 ng/g和0.5~5 ng/g(圖6)。

        圖6 金魚體內(nèi)吡蟲啉及其代謝物含量

        3 結(jié)論

        本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法確定了吡蟲啉在金魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉和6-氯煙酸,并且建立了準確的測量方法。該方法的精密度和準確度較高,線性關(guān)系良好,是一種可行的分析方法,可以用于金魚體內(nèi)的吡蟲啉及其代謝物的定性以及定量分析。

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