付瑞強，張燕寧，毛連綱，朱麗珍，蔣紅云，劉新剛，張 蘭

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

四氯蟲酰胺（tetrachlorantraniliprole）是國內(nèi)創(chuàng)制的一種雙酰胺類殺蟲劑（圖1），其對水稻二化螟、稻縱卷葉螟效果優(yōu)異[1]，對蚜蟲類、葉蟬類、飛虱類以及部分鞘翅目和雙翅目害蟲也具有較好的防效[2]。四氯蟲酰胺是以氯蟲苯甲酰胺為先導(dǎo)化合物進行結(jié)構(gòu)修飾得到，二者都屬于鄰甲酰氨基苯甲酰胺類化合物。通過與魚尼汀受體結(jié)合，打開鈣離子通道，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子持續(xù)釋放到肌漿中[3]，鈣離子和肌漿中基質(zhì)蛋白結(jié)合，進而引起害蟲肌肉持續(xù)收縮，靶標(biāo)害蟲因此表現(xiàn)為抽搐、麻痹、拒食，最終死亡[4]。

圖1 四氯蟲酰胺結(jié)構(gòu)式

鑒于雙酰胺類殺蟲劑的潛在環(huán)境風(fēng)險，四氯蟲酰胺對環(huán)境和非靶標(biāo)生物的安全性也需引起關(guān)注。有研究證明，四氯蟲酰胺對天敵昆蟲、家蠶、蜜蜂、水生生物存在潛在風(fēng)險[5]；張琦等[6]研究證明氯蟲苯甲酰胺和四氯蟲酰胺2種雙酰胺類農(nóng)藥對2齡家蠶毒性均屬于中毒，在應(yīng)用于桑園害蟲防治中該農(nóng)藥毒性殘留相對其他農(nóng)藥較低，四氯蟲酰胺相比氯蟲苯甲酰胺對家蠶的毒性更強。且四氯蟲酰胺在土壤中不易降解，在pH=7的水中中等光解，其在土壤中也較易被吸附[7]。

大型溞（Daphnia magna）廣泛分布于淡水、海水和內(nèi)陸半咸水中[8]，其作為受試生物的優(yōu)點為：對環(huán)境變化的敏感性高，繁殖周期短，容易培養(yǎng)，體型透明易觀察等[9]。本文以四氯蟲酰胺設(shè)計暴露濃度，進行大型溞生長、發(fā)育、繁殖等指標(biāo)測試，主要包括首胎時長、初次產(chǎn)溞數(shù)、單雌總產(chǎn)溞數(shù)、產(chǎn)胎數(shù)、蛻皮次數(shù)、體長等[10]，評價四氯蟲酰胺對浮游動物的毒理效應(yīng)，為四氯蟲酰胺使用對水生生物影響的環(huán)境風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

91.3%四氯蟲酰胺原藥，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供；99.9%四氯蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，天津阿爾塔科技有限公司；乙腈（色譜純），F(xiàn)isher公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；乙腈（分析純），北京市通廣精細(xì)化工公司；甲酸（分析純）、氯化鈉（分析純）、無水硫酸鎂（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

萬分之一天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；人工氣候箱，寧波海曙賽福儀器廠；150 mL燒杯，北京廣達恒益科技有限公司（北玻博美）；體式鏡OLYMPUS SZX10，廣州市明美光電技術(shù)有限公司；全溫度光照振蕩器DHZ-DB，寧波海曙賽福儀器廠；超高效液相色譜儀Agilant 1290-DAD，美國安捷倫科技有限公司；三重四極桿質(zhì)譜儀SCIEX TRIPLE QUAD 3500，SCIEX 公司；高速離心機75007211，Thermo公司。

1.2 試驗生物

大型溞，引自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，于室內(nèi)多年飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為（22±1）℃，L//D=16 h//8 h，每24 h投喂一次近頭狀尖胞藻（Pseudokirchneriella subcapitata）（濃度約為1.00×106個/mL）。

試驗用溞為24 h內(nèi)的非頭胎溞，來源于同一母系，且母溞保種培養(yǎng)期間未表現(xiàn)出任何受脅迫現(xiàn)象，例如死亡率高、出現(xiàn)雄溞和冬卵、頭胎延遲、體色異常等。試驗用溞在試驗條件下馴養(yǎng)至少3 w。馴養(yǎng)期間，大型溞的日常培養(yǎng)條件如光照、溫度、飼喂量等須與試驗條件一致。每24 h投喂一次近頭狀尖胞藻，每48 h更換曝氣自來水。

1.3 儀器分析條件

（1）液相色譜。Agilent 1290 Infinity 型液相色譜儀（UHPLC），SCIEX TRIPLE QUAD 3500質(zhì)譜儀；色譜柱：Acquity UPLC BEH C18，2.1 mm×50 mm（1.7 μm）；柱溫箱：35℃；進樣量：2 μL；流動相洗脫：A：0.2%甲酸水，B：色譜純乙腈。洗脫程序見表1。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫參數(shù)

表2 MRM 模式下四氯蟲酰胺質(zhì)譜分析參數(shù)

（2）質(zhì)譜分析條件。電離方式：電噴霧電離（ESI），負(fù)離子；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；離子源噴針電壓（IS）：4 500.0V；離子源溫度（TEM）：500.0℃；碰撞氣（CUR）：68.95 kPa；氣簾氣（CAD）：55.16 kPa；離子源氣1（GS1）：344.75 kPa；離子源氣2（GS2）：413.7 kPa。

1.4 四氯蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用電子天平準(zhǔn)確稱取1.01 mg四氯蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈做溶劑，配制100 mg/L的儲備液10 mL，繼續(xù)用乙腈分別稀釋成0.30、0.50、1.00、3.00、6.00、10.00 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3的條件下進行測定，以峰面積和進樣濃度為縱、橫坐標(biāo)做圖，得到四氯蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸曲線。

1.5 水樣中四氯蟲酰胺檢測

量取10 mL水樣于50 mL離心管中，加入10 mL萃取液（0.2%甲酸乙腈），在振蕩機上振蕩提取15 min后，加入氯化鈉1 g，無水硫酸鎂4 g，搖勻后再次振蕩提取5 min。置于臺式高速離心機以4 000 r/min離心5 min，分液后移取8 mL上清液至10 mL離心管中，吸取適量上清液過0.22 μm有機濾膜待測。

1.6 試驗中暴露溶液的配制

準(zhǔn)確稱取91.30%的原藥10.95 mg溶于50 mL水中，加入100 μL丙酮后超聲助溶，并定容至100 mL，得到母液濃度為100 mg/L的試驗藥液，應(yīng)用于急性毒性試驗和繁殖毒性試驗。

1.7 急性毒性試驗

參考經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）化學(xué)品測試準(zhǔn)則202[11]和童麗麗等[12]的方法并稍作改進。用1.6中母液稀釋為1 mg/L后，配制急性毒性試驗濃度依次為0、1.00×10-3、1.50×10-3、2.30×10-3、3.00×10-3、4.00×10-3、6.00×10-3mg/L的四氯蟲酰胺溶液。其中曝氣水為空白對照組，0.1%丙酮為溶劑對照組。在每個150 mL燒杯中加入供試藥液75 mL和5只幼溞（出生6～24 h之內(nèi)的非頭胎溞），每處理設(shè)置4個平行試驗共20只小溞。急性毒性試驗期間不喂食，培養(yǎng)條件同1.2小節(jié)所述。分別在24 h和48 h觀察并記錄大型溞的活動受抑制情況（或死亡率），并分析急性毒性結(jié)果。

1.8 繁殖毒性試驗

參考經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）化學(xué)品測試準(zhǔn)則211[13]進行試驗并稍作修改。根據(jù)1.6中的急性毒性試驗結(jié)果，參照48 h-EC50值1.31×10-3mg/L，分別設(shè)置1.25×10-6、6.25×10-6、2.50×10-5、5.00×10-5、1.00×10-4mg/L 5個暴露濃度，設(shè)曝氣水為空白對照組，同時設(shè)置0.1%的丙酮為溶劑對照，每個處理設(shè)置3個平行試驗。在每個150 mL燒杯中加75 mL試驗藥液，每個燒杯中飼養(yǎng)1只溞，每24 h喂食一次，間隔48 h更換試驗藥液。

試驗周期為21 d，期間培養(yǎng)條件同1.2小節(jié)，每24 h統(tǒng)計大型溞首胎時長、蛻皮次數(shù)、產(chǎn)小溞數(shù)、產(chǎn)胎數(shù)，并記錄21 d內(nèi)的死亡率和單雌總產(chǎn)溞數(shù)。在試驗的最后1 d即第21 d，在體式鏡下測量存活大型溞的體長（含肛刺）。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用胡好遠(yuǎn)等[14]的方法計算種群內(nèi)稟增長率；IBM SPSS Statistics 19軟件分析四氯蟲酰胺對大型溞急性毒性和繁殖毒性數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 試驗藥液中四氯蟲酰胺穩(wěn)定性分析

在0.3～10 μg/L范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=3705.1x＋65.552，R2=0.9972。根據(jù)測定的質(zhì)量濃度，換算得四氯蟲酰胺的質(zhì)量濃度（表3）。結(jié)果表明，所測定的0.50、3.00、6.00 μg/L濃度處理組0 h和48 h的實測濃度與理論濃度的偏差小于20%。因此，本研究中大型溞急性運動抑制試驗過程中可不更換藥液，在繁殖毒性試驗21 d暴露過程中每48 h更換一次藥液。

表3 四氯蟲酰胺在試驗水樣中48 h 實測濃度

2.2 急性毒性

在大型溞急性毒性試驗中，空白對照組及溶劑對照組大型溞均活動正常，無死亡。證明此次試驗選用的大型溞狀態(tài)良好，試驗結(jié)果可靠。其具體受抑制情況如表4所示。

表4 四氯蟲酰胺大型溞急性毒性試驗結(jié)果

根據(jù)表4，以IBM SPSS Statistics 19進行分析，得到四氯蟲酰胺對大型溞急性毒性試驗測定結(jié)果如表5，依據(jù)GB/T 31270.13—2014《化學(xué)農(nóng)藥安全評價試驗準(zhǔn)則第13部分：溞類急性活動抑制試驗》[15]中的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，四氯蟲酰胺對大型溞急性毒性等級為劇毒。

表5 四氯蟲酰胺對大型溞急性毒性試驗48 h 測定結(jié)果

2.3 繁殖毒性

試驗進行到21 d時，空白對照組及溶劑對照組中大型溞存活率為80%，表明試驗結(jié)果可靠。由表6可以看出四氯蟲酰胺可影響大型溞的首胎時長，空白對照組與5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L處理組有顯著差異（p＜0.05），兩個濃度組使大型溞的首胎時長顯著縮短；對初次產(chǎn)溞數(shù)來說，2.50×10-5、6.25×10-6、1.25×10-6mg/L 3個處理組間差異不顯著。四氯蟲酰胺暴露，縮短了大型溞首胎時長，而對其初次產(chǎn)溞數(shù)有低濃度促進，高濃度抑制的現(xiàn)象。

表6 四氯蟲酰胺對大型溞首胎時長和初次產(chǎn)溞數(shù)的影響

表7為四氯蟲酰胺對大型溞單雌總產(chǎn)溞數(shù)和平均產(chǎn)胎數(shù)的影響。由表中數(shù)據(jù)可以看出，各濃度處理組對單雌總產(chǎn)溞數(shù)無顯著影響。濃度為1.25×10-6～5.00×10-5mg/L的單雌總產(chǎn)溞數(shù)多于對照組單雌總產(chǎn)溞數(shù)，但濃度達到1.00×10-4mg/L時，單雌總產(chǎn)溞數(shù)降低；對于單雌平均產(chǎn)胎數(shù)來說，四氯蟲酰胺顯著促進其產(chǎn)胎，5個濃度的處理組平均產(chǎn)胎數(shù)均高于兩對照組，其中，2.50×10-5、5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L處理組相比2個對照組有顯著差異。

表7 四氯蟲酰胺對大型溞單雌總產(chǎn)溞數(shù)和平均產(chǎn)胎數(shù)的影響

表8為四氯蟲酰胺對大型溞蛻皮次數(shù)和體長的影響。由表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著濃度的升高，大型溞21 d體長無顯著差異；而四氯蟲酰胺對大型溞平均蛻皮次數(shù)也無顯著影響。

表8 四氯蟲酰胺對大型溞蛻皮次數(shù)和體長的影響

采用胡好遠(yuǎn)等[14]的方法計算種群內(nèi)稟增長率，由表9可看出四氯蟲酰胺暴露后，其種群內(nèi)稟增長率無明顯變化，空白對照和溶劑對照內(nèi)稟增長率均為0.24；5個藥劑處理的內(nèi)稟增長率為0.23～0.25，表明該試驗濃度的持續(xù)暴露不會影響大型溞種群的繁衍。

表9 四氯蟲酰胺對大型溞種群內(nèi)稟增長率的影響

3 結(jié)論

四氯蟲酰胺在土壤中的殘留期比較長，移動比較活躍，所以一旦該藥在環(huán)境中富集到一定濃度，就會對非靶標(biāo)生物乃至其他生物產(chǎn)生慢性毒性[16]。本研究以四氯蟲酰胺為供試藥劑，以大型溞為評估對象，研究了該藥劑對大型溞的急性毒性及繁殖毒性。急性毒性結(jié)果顯示，四氯蟲酰胺對大型溞EC50為1.31×10-3mg/L，表明該藥劑對大型溞急性毒性等級為劇毒。在供試藥劑暴露21 d后，評估其對大型溞的生長發(fā)育和繁殖的影響，試驗數(shù)據(jù)表明，四氯蟲酰胺對大型溞的繁殖存在一定毒性：5.00×10-5、1.00×10-4mg/L濃度組使大型溞的首胎時長顯著提前，而對其初次產(chǎn)溞數(shù)有低濃度促進，高濃度抑制的現(xiàn)象。各濃度處理組對單雌總產(chǎn)溞數(shù)無顯著影響，處理組單雌總產(chǎn)溞數(shù)稍多于空白對照組單雌總產(chǎn)溞數(shù)。對于平均產(chǎn)胎數(shù)來說，2.50×10-5、5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L濃度處理組顯著促進其產(chǎn)胎。但是其對大型溞的體長無顯著抑制作用，隨著濃度的升高，大型溞體長無顯著變化。四氯蟲酰胺對大型溞平均蛻皮次數(shù)也無顯著影響。本研究結(jié)果表明，四氯蟲酰胺對大型溞體長、蛻皮次數(shù)、單雌總產(chǎn)溞數(shù)無顯著影響，對首胎時長和平均產(chǎn)胎數(shù)有促進作用，而對種群繁衍無不良影響。綜上，四氯蟲酰胺在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用對大型溞存在潛在風(fēng)險，有必要進一步進行包括生態(tài)毒理學(xué)風(fēng)險評估在內(nèi)的一系列試驗。