李盈盈,周 璐,榮宏偉,魯錳業(yè),王競茵,崔佰慧,郭大濱

(廣州大學土木工程學院,廣東廣州 510006)

隨著全世界人口的增長和經濟的提升,人們對營養(yǎng)需求日益增加,海產品逐漸成為主要的蛋白質來源,海產養(yǎng)殖業(yè)迅速擴張。自2002年以來,我國一直是世界上最大的水產品貿易國,水產品出口量一直位居世界第一[1]。根據《2021中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》[2],2016年—2020年,我國海水養(yǎng)殖產量逐年增長,2020年我國海洋產品總產量達到5 224萬t,其中海水養(yǎng)殖產量為2 135萬t,約占海洋總產量的40.87%。

然而,在海產養(yǎng)殖過程中,大量的動物排泄物和未被使用的飼料會導致水體中的污染物含量劇增,如N、P和COD[3]。未經處理的廢水直接排入水環(huán)境中可能會導致水體富營養(yǎng)化,對環(huán)境造成潛在風險。同時,為了預防和治療魚蝦類疾病,水產養(yǎng)殖飼料中常常含有抗生素。70%～80%的抗生素未能被使用,殘留的抗生素對水環(huán)境造成了嚴重的威脅[4]。其中,磺胺類是水產養(yǎng)殖廢水中檢出率較高的抗生素之一[5]。2019年,我國政府對水產養(yǎng)殖業(yè)提出“綠色健康發(fā)展”的相關意見,要求養(yǎng)殖廢水中的污染物應在排放前被有效去除,實現養(yǎng)殖廢水的循環(huán)利用。

近年來,基于微藻細菌共生系統(tǒng)去除污染物的技術逐漸興起。微藻通過光合作用產生O2,供給細菌代謝繁殖?；钚晕勰嘀械募毦ㄟ^呼吸釋放CO2,為微藻提供CO2進行光合作用[6]。通過這種共生機制,菌藻共生比傳統(tǒng)活性污泥對氨氮和P的去除率更高[7]。值得注意的是,藻類的生長代謝與光照直接相關。Matos等[8]和Yan等[9]的研究表明,光照強度對微藻去除廢水中的污染物有顯著影響。當光照強度過高時,水中的微藻和細菌都會受到光抑制作用,導致出水水質變差[10]。Marcilhac等[11]的研究表明,在244 μmol/(m2·s)的光量子通量密度下,菌藻共生系統(tǒng)對N的去除率最大,可達8.5 mg N/(L·d),并發(fā)現氨氧化細菌受到微藻生長的影響。Meng等[12]發(fā)現光量子通量密度≥90 μmol/(m2·s)時,更利于氨氧化細菌和藻類的富集,對N和P的去除更加高效。Gao等[13]在光照強度為5 000 lux時獲得了最佳養(yǎng)分去除效率,去除了98.1%的CODCr、70.7%的氨氮和90.0%的TP。由此可見,要達到菌藻共生系統(tǒng)的高效處理效率,光照強度是重要的因素。但目前缺少光照強度對微藻細菌共生系統(tǒng)處理海產養(yǎng)殖廢水的相關研究,也沒有對抗生素去除研究的報道。

本研究的目的是,采用懸浮態(tài)菌藻共生系統(tǒng),通過改變光照強度,選取磺胺甲惡唑(SMX)為主要抗生素,探究光照強度對海產養(yǎng)殖廢水中營養(yǎng)物質及抗生素的處理效果。同時,對微藻細菌活性、胞外聚合物(EPS)分泌量和微生物群落進行比較,得到最佳光照強度,為工程的實際應用奠定理論依據。

1 試驗材料和方法

1.1 小球藻擴培

海水小球藻(GY-H4chlorellasp.)購自上海光語生物科技有限公司,采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。在500 mL錐形瓶中,按照藻液∶培養(yǎng)基=1∶5的體積比接種,放置于溫度為25 ℃、光照強度為2 500 lux、明暗比為12 h∶12 h的光照培養(yǎng)箱中進行擴培。通過波長為680 nm的紫外分光光度法每天檢測藻細胞的生長,得到OD680與海水小球藻干重的相關函數,如式(1)。

Y=0.341 63x-0.005 63,R2=0.998 54

(1)

其中:Y——海水小球藻干重,g/L;

x——檢測得到的OD680。

1.2 活性污泥耐鹽性馴化

好氧活性污泥取自廣州南村污水處理廠。增加海水晶將廢水鹽度從0調節(jié)至3%,經過60 d馴化培養(yǎng),獲得耐鹽活性污泥,將活性污泥作為接種菌種。

1.3 試驗設計

本試驗以體積為500 mL的錐形瓶作為序批式活性污泥法(SBR)反應器。環(huán)境溫度為25 ℃,明暗比為12 h∶12 h,藻菌比為1∶3(120 mg/L∶360 mg/L),設置光照強度為2 000、4 500、7 000、9 500 lux,分別記為AS2000、AS4500、AS7000、AS9500。為保證菌藻充分接觸,采用磁力攪拌器以200 r/min攪拌。24 h為1個周期,22 h攪拌,100 min沉淀,10 min出水,10 min進水。由于藻類沉降性較差,避免藻類過多流失,試驗第1 d不排水,以母液形式加入污染物,后續(xù)每天體積交換率為25%。

1.4 水質分析方法

水樣通過0.22 μm聚醚砜濾膜,測定進出水SMX含量。采用高效液相色譜法(1100,安捷倫,美國)測定SMX的含量。測定所用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,3.5 μm),柱溫控制在30 ℃。流動相為甲醇-甲酸水(0.1%),體積比為49∶51,流速為0.2 mL/min,檢測波長設為270 nm。根據試驗開始時和試驗結束時的SMX濃度計算SMX的去除率。

1.5 海水小球藻活性和微生物活性的表征

本試驗通過葉綠素a衡量小球藻生長情況,使用95%乙醇測定葉綠素a含量,每2 d進行一次檢測。取試驗末期的菌藻混合物測定微藻和細菌活性。采用黑白瓶法測定菌藻混合液的光合產氧速率(SOGR)來表征海水小球藻活性[15]。各反應器的微生物活性以比氧吸收率(SOUR)、比氨氧化速率(SAUR)和比硝化速率(SNUR)表示[16]。

1.6 EPS提取

EPS主要包括松散結合的EPS(LB-EPS)和緊密結合的EPS(TB-EPS)[17]。取試驗末期的菌藻混合物,采用熱提取法提取LB-EPS和TB-EPS[18]。分析LB-EPS和TB-EPS中的總有機碳(TOC)、蛋白質(PN)和多糖(PS)含量。TOC通過TOC分析儀(TOC-LcpH/CPN,Shimadzu)測量,PN按照Lowry方法測量[19],用苯酚-硫酸法測定PS含量[20]。

1.7 高通量測序

取試驗結束后接種污泥的試驗組進行高通量測序。微生物多樣性測序工作由Majorbio生物制藥科技有限公司(中國上海)完成。整個測序基本流程主要包含DNA提取、PCR擴增及產物純化、PCR產物的定量和均一化、測序文庫構建以及雙端測序。通用引物對341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGTATCTAATCC-3′)用于擴增靶向V3～V4區(qū)域的細菌16S rRNA區(qū)域[21]。然后將PCR產物在Illumina MiSeq平臺上進行測序。生物信息學分析在Majorbio I-Sanger(https://cloud.majorbio.com/)上進行。

2 結果和討論

2.1 小球藻生長情況

光合作用是光照損傷和自我恢復的動態(tài)平衡,而葉綠素是進行光合作用的主要光合色素。圖1為不同光強下的葉綠素a含量。隨著試驗的推進,各試驗組中的葉綠素a質量濃度分別從開始的1.67 mg/L左右上升至結束時的3.36、4.39、4.54、4.60 mg/L。在試驗前期,小球藻處于快速生長階段,并且在第4 d的生長速率達到最大,隨后逐漸趨于平緩。但是當光照強度為7 000 lux和9 500 lux時,至試驗末期,葉綠素a含量開始出現負增長?？赡苤饕幸韵聝蓚€原因:1)中高光強下,微藻生長不受限制,藻密度不斷上升,最終造成自遮蔽現象,過量的小球藻無法捕獲到足夠的光能,光合效率下降,同時水中分泌的過量藻毒素對小球藻造成毒害作用;2)長期處于過高的光照強度下,小球藻吸收過量的光能會破壞光合色素,抑制光合作用而發(fā)生光抑制現象,同時高強度的光照會引起藻細胞膜的損傷,導致藻細胞的死亡[22]。當光照強度為2 000 lux時,由于活性污泥的遮蔽,藻細胞吸收的光能較弱,光合作用效率低下,小球藻生長受限,葉綠素a含量低下。

圖1 不同光照強度下葉綠素a含量

2.2 CODCr的去除

圖2為不同光強下CODCr的去除效率。經過14 d的共生培養(yǎng),所有反應器的出水CODCr質量濃度均低于6 mg/L,平均去除率可以達到94%以上,光照強度為4 500 lux時,CODCr去除率最高,為96.87%。這說明不同光強下小球藻均能通過光合作用為菌藻共生系統(tǒng)提供DO,保障微生物的生長,并能較好地去除有機物。對不同光照強度下CODCr的去除率進行以光照強度為單因素的顯著性分析,P值為0.059(>0.05),差異不顯著。因此,在本試驗的試驗周期內,光照強度對菌藻共生系統(tǒng)去除CODCr沒有顯著影響。

圖2 不同光照強度下CODCr去除率

2.3 氮素的去除

不同光照強度下,菌藻共生系統(tǒng)脫氮效率如圖3(a)所示。當光照強度為4 500 lux時,TN去除效果最佳,為95.70%,其次分別為84.59%(2 000 lux)、76.05%(7 000 lux)和57.75%(9 500 lux)。

圖3 不同光照強度下TN去除效率和氨氮出水含量

圖4 一個試驗周期內不同光照強度下出水氨氮含量和TN去除率

2.4 磷酸鹽去除

圖5 不同光照強度下去除率 Removal Rate under Different Light Intensities

圖6 一個試驗周期內不同光照強度下去除率 Removal Rate under Different Light Intensities in a Experimental Period

2.5 SMX的去除

由圖7可知,光照強度為4 500 lux時,SMX的去除率最高,為95.67%,比其余光照強度條件下分別高了7.99%(2 000 lux)、19.24%(7 000 lux)和61.32%(9 500 lux)。SMX的酸度系數(pKa)為5.6～6.6,在高于pKa的pH下,SMX會以帶負電的形式存在,被帶負電的微藻細胞排斥[25]。在本試驗中,pH值始終維持在7.8以上。同時,SMX的水分配系數(LogKow)值低于1,為 0.89,表現出親水性的特質,與細胞的吸附結合有限[26]。Rodrigues等[27]的研究也表明,菌藻共生系統(tǒng)對SMX的生物吸附非常低,只有1.26%。此外,Bai等[28]和Xiong等[29]的研究表明,SMX的生物吸收、生物累積和光降解非常低或微不足道。由于基于底物相互利用的協(xié)同機制,微藻細菌共生體可以更好地代謝藥物化合物[30],對抗生素降解比其他生物處理系統(tǒng)更徹底和有效[31-32]。因此,本試驗中,大部分SMX由細菌和微藻共同生物降解完成。在試驗周期前4 d,各反應器去除SMX的去除效率迅速上升,之后各反應器的去除效率逐步降低,直到第8 d才逐步趨于穩(wěn)定。在低光照強度至中高光照強度(2 000 ～7 000 lux)下,SMX的去除效率均比高光照強度條件下要高。由此可見,過高的光照強度不利于細菌和微藻協(xié)同作用去除SMX。當光照為9 500 lux時,光能充足,試驗初期小球藻生長不受限,但是細菌受到的光照抑制作用是所有試驗組中最高的,故SMX去除效率較低,到第4 d為50.8%。隨后,對SMX的去除效率開始下降。這可能是因為,在第4 d,葉綠素a的增長速率達到最大,開始大量繁殖,在第8 d達到最高,為4.90 mg/L。小球藻的無限制生長,打破了和細菌之間的共生關系,變?yōu)楦偁庩P系,共同生物降解SMX的模式也被打破。由于光照對細菌的抑制作用,微藻成為SMX的主要處理者,去除率始終維持在34.0%左右。在Yu等[33]的研究中,采用海水小球藻處理人工海產養(yǎng)殖廢水中的SMX,去除率達到41%～50%。類似地,Chen等[26]采用小球藻處理磺胺類抗生素,去除率可達33%左右。因此,小球藻對磺胺類抗生素的去除率在33%～50%,與本試驗高光照強度條件下的結果相似。

圖7 不同光照強度下SMX去除率

圖8為一個試驗周期內不同光照強度下SMX的去除率?？梢悦黠@觀察到,在光照階段,即0～6 h和12～18 h,SMX去除效率迅速上升,0～6 h時最高可達70%左右;而黑暗階段,即12～18 h和18～24 h,SMX的去除效率趨于平緩,總體增加只有10%左右。與本試驗結果相同的還有在Hu等[34]的試驗中,當SMX質量濃度為1 mg/L時,菌藻共生系統(tǒng)在光照條件下對SMX的去除率可達50%～80%,而在黑暗條件下只有15%～20%。這可能是因為,低濃度的SMX對共生系統(tǒng)中的小球藻幾乎沒有影響,并且EPS的過量產生降低了菌藻共生系統(tǒng)對SMX的敏感性[29]。

圖8 一個試驗周期內不同光照強度下SMX去除效率

2.6 微生物活性

如圖9(a)所示,對不同光強下菌藻共生系統(tǒng)的小球藻活性進行了比較,2 000、4 500、7 000、9 500 lux時分別為23.55、30.93、21.09、16.06 μmol O2/(mg Chl-a·h)。小球藻活性隨光照強度的增加,呈現先上升后下降的趨勢。光照強度是影響微藻生長的主要環(huán)境因素,過低會限制光合速率,過高會對微藻產生光抑制作用[23]。本試驗中,由于活性污泥對光照的遮蔽作用,在2 000 lux光照強度下微藻生長更加受到限制,活性降低。當光照強度為7 000 lux和9 500 lux時,試驗初期光能充足,小球藻生長繁殖不受限制,葉綠素a含量迅速上升。到試驗末期,自遮蔽現象加劇,光反應受到限制,無法提供足夠的ATP和NADPH進行CO2的吸收利用,暗反應的效率被削弱,小球藻活性降低,葉綠素a含量也下降。

圖9 微藻活性和細菌活性比較

如圖9(b)所示,對不同光強下菌藻共生系統(tǒng)中細菌活性進行比較,包括細菌總活性SOUR、亞硝酸鹽細菌活性SAUR和硝酸鹽細菌活性SNUR。同微藻活性SOGR一樣,隨著光照強度的提升,呈現先上升后下降的趨勢,2 000、4 500、7 000、9 500 lux時依次為38.92、44.57、16.26、10.01 mg O2/(g VSS·h)。同時,可以發(fā)現細菌活性與系統(tǒng)脫氮效率呈現正相關的趨勢。光照強度越高,細菌總活性越低,光照對硝化細菌的抑制作用越高,這主要是因為參與硝化作用能量傳導途徑的AOB和NOB細胞色素均被強光破壞[35],從而無法進行高效的脫氮作用。然而,在低光強下,小球藻生長受到抑制,小球藻無法攝取到足夠的O2,活性降低。

2.7 EPS分析

表1 不同光照強度菌藻共生系統(tǒng)試驗前后的EPS中TOC含量

試驗結束后EPS中PS和PN的含量及PN/PS如圖10所示。光照強度為4 500 lux時,PS和PN含量最高,PS分別為20.07 mg/(g VSS)(LB-EPS)和26.83 mg/(g VSS)(TB-EPS),PN分別為48.76 mg/(g VSS)(LB-EPS)和59.65 mg/(g VSS)(TB-EPS)。在4個光照強度下,無論是LB-EPS,還是TB-EPS,PN含量均占主體。EPS中的PN越高,說明菌藻膠團內部的聯結越緊密。同時,PN也具有穩(wěn)定污泥絮體結構的作用,因此,更高的PN含量更利于活性污泥架構更加穩(wěn)定的菌藻膠團,使得菌藻膠團實現更加高效的同步硝化反硝化過程。并且,由于PN對于SMX的轉運作用[43],SMX可以在菌藻膠團內部逐漸降解,提高對SMX的去除率。

圖10 不同光照強度下試驗結束后EPS中PS和PN含量

2.8 微生物群落分析

2.8.1 α-多樣性分析

α-多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性,常用的度量標準有Chao 1、ACE、Shannon、Simpson、Coverage指數。Chao 1指數和ACE指數用于表征物種的豐富指數,Shannon指數和Simpson指數用于表征物種的多樣性,Coverage指數主要指測序對物種的覆蓋度。一般來說,Chao 1指數和ACE指數值越大,說明群落的豐富度越高;Shannon指數值越高,說明群落的多樣性越高;而Simpson指數值越大,表明群落的Alpha多樣性越差。

由表2可知,光照強度對菌藻共生系統(tǒng)中的微生物豐富度和多樣性有影響。光照強度為4 500 lux試驗組中的微生物群落結構最豐富,其次是2 000 lux和7 000 lux,最小的為9 500 lux,這說明過高的光照強度和過低的光照強度對于提高系統(tǒng)的微生物豐富度存在副作用。與之不同的是,光照強度的提高與微生物的多樣性呈現負相關,光照強度越高,Shannon指數越低且Simpson指數越高,這可能是小球藻對高光照強度的趨向性并占據主體地位,同時不耐高光照強度的細菌豐度逐漸減少,系統(tǒng)中只有部分耐光細菌成為優(yōu)勢菌屬,物種多樣性下降。

表2 不同光強菌藻共生系統(tǒng)微生物α-多樣性指數

2.8.2 主成分分析(principal component analysis,PCA)

PCA用于分析樣本間的差異和距離,樣品組成越相似,反映在PCA圖中的距離越近。不同光照下菌藻共生系統(tǒng)的PCA如圖11所示。主成分(PC1)和主成分 2(PC2)是兩個最主要的樣品差異特征,最大比率分別為49.86%和28.12%。其中AS2000和AS4500的樣品傾向聚集在一起,而AS7000和AS9500與之相較甚遠,這說明光照強度會對微生物群落組成造成差異,在低光強下的差異較小,高光強下差異較大,這可能是某些細菌的不耐光性引起的。

圖11 不同光照強度菌藻共生系統(tǒng)PCA

2.8.3 微生物群落結構組成

圖12(a)為不同光強的菌藻共生優(yōu)勢細菌門水平的相對分布。各試驗組中的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門 (Planctomycetes)、藍細菌門(Cyanobacteria)和脫硫桿菌門(Desulfobacterota)。其中變形菌門的豐度最高,2 000、4 500、7 000、9 500 lux時分別為84.32%、88.46%、75.38%、71.97%。Mével等[44]的研究表明,Proteobacteria 具有降解有機物和硝化-反硝化的功能。因此,本試驗中,脫氮效果與Proteobacteria的豐度呈現正相關,并且在Proteobacteria豐度較高的光照強度為4 500 lux的共生系統(tǒng)中,脫氮效果最好。隨著光照強度的增加,Bacteroidetes的豐度逐漸升高。這是由于藻類的生長會抑制Bacteroidetes的生長[45],但是到試驗后期,高光照強度對藻細胞造成損傷,小球藻逐漸走向衰亡,Bacteroidetes生長不受限制,豐度增加。相似的是,Planctomycetes在高光照強度下的豐度也明顯高于中低光強,許多研究[46-51]報道了藻華后Planctomy-cetes的高豐度。同時,長時間的高強度光照會使得共生系統(tǒng)中的Cyanobacteria豐度增加,藍藻細菌的過度生長可能形成有害的藻華,并導致海產養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質問題[52]。由此可見,光照強度會改變菌藻共生系統(tǒng)中的微生物群落結構,高強度的光照會降低硝化反硝化菌屬的豐度水平,增加不利于系統(tǒng)長久穩(wěn)定運行菌屬的豐度。

圖12 不同光照強度下的菌藻共生系統(tǒng)優(yōu)勢細菌相對分布

圖12(b)為不同光照強度的菌藻共生優(yōu)勢細菌屬水平的相對分布。其中,占比最高的為Unclassified_f_Rhodobacteraceae、Aestuariicoccus和Ruegeria,均屬于α-變形菌綱的海洋紅桿菌科。據報道,海洋紅桿菌科是海洋微生物群的重要成員,占海洋原核生物DNA的40%[53],通過間接接觸促進其他細菌物種的初始定殖和生物膜形成,是優(yōu)秀的生物膜形成生物[54]。同時,海洋紅桿菌科是B12營養(yǎng)缺陷原核生物和真核生物初級生產者的主要維生素供應商,如綠藻、硅藻、甲藻、球藻和褐藻,而維生素B12是許多真核藻類所必需的生長因子[55]。當光照強度為4 500 lux時,以上3種菌的豐度之和最高,這可能會增加小球藻的活性,并且促進菌藻共生系統(tǒng)中EPS的分泌,使得細菌和微藻之間的信號交換更加便利,提高系統(tǒng)的處理效能。隨著光照強度的提高,Unclassified_f_Rhodobacteraceae和Aestuarii-coccus豐度之和逐步下降(2 000～9 500 lux時分別為62.03%、63.02%、41.70%和2.54%),而Ruegeria和Stappia豐度之和大幅提升(2 000～9 500 lux時分別為2.74%、3.84%、16.47%和53.88%)。這說明光照強度會改變微生物屬水平的群落結構,提高光照強度,耐光的細菌會逐漸替代對光照不耐受的細菌。據報道[56],Ruegeria和Stappia的序列與光合細菌的序列非常相似,并且有助于在廣泛的海洋環(huán)境中參與C和N循環(huán)的好氧和厭氧過程。同時,Muricauda、Marivita和Halomonas的豐度與光照強度也呈正相關的關系,研究[57-58]發(fā)現,Muricauda、Marivita和Halomonas屬于需氧和化學異養(yǎng)菌,可以有效抑制微藻赤潮的發(fā)生。除此之外,光照強度對系統(tǒng)中的反硝化細菌也有明顯的抑制作用,光照強度為9 500 lux時,Marinicella的豐度只有0.44%,2 000、4 500、7 000 lux時依次為7.54%、6.92%和6.61%。值得注意的是,Norank_f_Microscillaceae是SMX的降解菌,有利于降解高濃度SMX[59]。當光照強度為4 500 lux的系統(tǒng)中,Norank_f_Microscilla-ceae的豐度最高,為8.7%,而在9 500 lux的系統(tǒng)中,只有0.18%。由此可見,光照強度對微生物群落結構有較大影響,過高的光照強度會降低處理海產養(yǎng)殖廢水的效能。

2.9 機理分析

3 結論

(2)光照強度過低會限制微藻進行光合作用,抑制微藻生長。光照強度過高會抑制細菌活性,無法為微藻提供足夠的CO2進行暗反應,微藻活性受到影響。

(3)細菌和微藻活性越高,EPS分泌量越多,SMX對二者的急性傷害越小。PN的大量分泌可以促進SMX的轉運,提高SMX的去除率。

(4)光照強度對菌藻共生系統(tǒng)的微生物群落結構有顯著影響。過高的光照強度會降低物種的多樣性和豐富度,使得系統(tǒng)中的細菌逐漸轉變?yōu)槟凸饧毦９庹諒姸扰cMuricauda、Marivita和Halomonas等抑制藻華的菌屬豐度呈正相關,與反硝化細菌Marinicella的豐度呈負相關。合適的光照強度有助于提高SMX降解菌Norank_f_Microscillaceae的豐度。