戈雅倩，謝和兵，4△，尼瑪次仁，白瑪?shù)┰?/p>

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012； 2. 江蘇省南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3. 江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司，江蘇 南通 226133； 4. 西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，西藏 日喀則 857000）

肉豆蔻是肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥種仁，廣泛栽培于熱帶地區(qū)，國內(nèi)主要分布于廣東、云南等地，香辛味濃烈，有溫中行氣、澀腸止瀉之效［1-2］。有研究表明，肉豆蔻富含黃酮類、揮發(fā)油、木脂素、苯丙素等有效成分［3］，有抗癌［4］、抗炎［5-6］、抗心肌缺血［7］、抗氧化［8］、預(yù)防腦損傷［9］等藥理作用。去氫二異丁香酚是肉豆蔻的指標(biāo)性化學(xué)成分。藏醫(yī)藥中，肉豆蔻常以生粉入藥用于治療心血管疾?。?0］，但在其加工過程中易出現(xiàn)變質(zhì)、腐敗等問題，影響藥品儲存和用藥安全［11-12］。故采取適宜的滅菌工藝是中藥產(chǎn)業(yè)化的重要部分［13］。本研究中采用電子加速器對肉豆蔻樣品進(jìn)行不同劑量的電子束輻照，通過比較樣品輻照前后的高效液相色譜（HPLC）圖、去氫二異丁香酚含量、總黃酮含量及微生物總數(shù)，評價電子束對肉豆蔻藥材的輻照效應(yīng)，為電子加速器輻照技術(shù)應(yīng)用于肉豆蔻藥材及含藥材中成藥的滅菌提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Essentia LC-16型高效液相色譜儀（配有SPD-16型紫外檢測器）、UV-1900i型紫外分光光度計，均購自日本Shimadzu 公司；XSR205DU/ AC 型電子天平（美國Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；WMS - 1037 型生物光學(xué)顯微鏡（上海無陌光學(xué)儀器有限公司）；UC - 250DE 型超聲波清洗儀（上海精其儀器有限公司）；TGL-16B 型臺式高速離心機(jī)（常州中捷實驗儀器制造有限公司）；DX-10/20 型電子加速器（中廣核戈瑞＜深圳＞科技有限公司）。

1.2 試藥

去氫二異丁香酚對照品（批號為17838 - 201804，含量為98.6%），蘆丁對照品（批號為100080-202012，含量為92.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。肉豆蔻藥材（安徽援康中藥飲片股份有限公司，批號為210501），經(jīng)江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司謝和兵高級工程師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備及輻照處理

取藥材適量，打成細(xì)粉，過2號篩，分裝于鋁箔袋密封，每袋12 g，共30 袋；采用電子加速器對樣品進(jìn)行輻照滅菌處理，輻照劑量分別為0，2，4，6，8，10 kGy，得到空白對照樣品和5種輻照樣品。

2.2 去氫二異丁香酚含量測定

色譜條件：色譜柱為Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（75∶25，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為274 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

溶液制備：取去氫二異丁香酚對照品適量，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度為30 μg/mL 的對照品溶液。取樣品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W、頻率40 kHz，下同）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗：按相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

含量測定：取對照品溶液和供試品溶液各適量，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。理論板數(shù)按去氫二異丁香酚峰計應(yīng)不低于3 000。按外標(biāo)法計算去氫二異丁香酚的含量。結(jié)果，各輻照樣品中去氫二異丁香酚含量與空白對照樣品間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 樣品去氫二異丁香酚和總黃酮含量測定結(jié)果（，n=3）Tab.1 Results of the content determination of dehydrodiisoeugenol and total flavonoids in the samples（，n=3）

表1 樣品去氫二異丁香酚和總黃酮含量測定結(jié)果（，n=3）Tab.1 Results of the content determination of dehydrodiisoeugenol and total flavonoids in the samples（，n=3）

輻照劑量（kGy）t值t值P值0.24 0.28 0.86 0.16 0.32 P值-1.04-3.02 0.06 2.34 3.61 0 2 4 6 8 1 0去氫二異丁香酚含量（mg/g）2.52±0.02 2.53±0.00 2.54±0.00 2.52±0.01 2.48±0.03 2.48±0.01 0.41 0.10 0.96 0.14 0.07總黃酮含量（mg/mL）1.18±0.02 1.04±0.07 1.22±0.02 1.20±0.08 1.33±0.02 1.28±0.04 1.63-1.45 0.21-2.22-1.31

2.3 相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）處理色譜圖，以空白對照樣品色譜圖為參照，經(jīng)過多點校正、全譜峰匹配，生成對照圖譜，并計算相似度。結(jié)果所有樣品間相似度均不低于0.998，共識別37 個共有峰，保留時間的RSD均小于2.0%。HPLC圖見圖1（R1為去氫二異丁香酚對照品，S1-S6分別為0，2，4，6，8，10 kGy輻照劑量樣品，表2同）。

表2 樣品高效液相色譜圖相似度評價Tab.2 Similarity evaluation of HPLC chromatograms of samples

2.4 總黃酮含量測定

供試品溶液制備：取樣品約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，4 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

線性關(guān)系考察：取蘆丁對照品0.010 88 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，得質(zhì)量濃度為0.201 mg/mL的對照品貯備液；分別精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置10 mL容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL、10%氯化鋁溶液0.3 mL、4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，靜置6 min，加水定容，搖勻，靜置15 min。以不加對照品的空白試劑為對照，于510 nm波長處測定吸光度。以待測成分質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.013 2X-0.004 5（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果顯示，蘆丁質(zhì)量濃度在0.010 0～0.050 2 mg/ mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗：按相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

含量測定：取樣品適量，按上述制備方法制備供試品溶液，以回歸方程計算含量，按去氫二異丁香酚含量測定項下方法處理數(shù)據(jù)。結(jié)果，輻照樣品中總黃酮含量與空白對照樣品間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.5 微生物檢查

參照2020 年版《中國藥典（四部）》通則1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法、通則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法及通則1107 非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，對樣品進(jìn)行隨機(jī)取樣，檢查細(xì)菌、霉菌和酵母菌、大腸菌群總數(shù)，均平行2次。結(jié)果樣品在輻照前后均未檢出大腸菌群；隨著輻照劑量的增加，細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)輻照劑量為8 kGy 時，細(xì)菌總數(shù)遠(yuǎn)低于藥典中非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，且未檢出霉菌和酵母菌；當(dāng)輻照劑量為10 kGy時，未檢出上述微生物。詳見表3。

表3 樣品微生物檢測結(jié)果（n=2）Tab.3 Results of microbial test of samples（n=2）

3 討論

3.1 輻照滅菌的應(yīng)用

中藥材的微生物控制是中藥材質(zhì)量提高的重要指標(biāo)。常規(guī)的中藥材滅菌方法主要為干熱、濕熱、微波等熱滅菌方式［14］。肉豆蔻藥材中含有大量的揮發(fā)性成分，常規(guī)的熱滅菌易導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分的逸失。輻照滅菌是一種冷滅菌技術(shù)［14-15］，具有溫度低、穿透性高等優(yōu)勢，尤其適用于肉豆蔻藥材等含揮發(fā)性成分或熱不穩(wěn)定性成分藥材的滅菌。傳統(tǒng)的輻照滅菌以60Co 為主，但存在建設(shè)及防護(hù)成本高、滅菌周期長等弊端，應(yīng)用受限。電子束輻照是一種新興的輻照滅菌技術(shù)，具有能量可控、束流定向、滅菌周期短、建設(shè)及防護(hù)成本低等優(yōu)勢，在醫(yī)療器械、生物醫(yī)藥、中藥、食品滅菌領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

3.2 中藥輻照滅菌的效應(yīng)評價

常規(guī)的中藥滅菌效應(yīng)評價以性狀、顯微鑒別、薄層鑒別為定性指標(biāo)，以微生物總數(shù)、單個或多個指標(biāo)成分的含量為定量指標(biāo)，但不能全面評價滅菌前后中藥物質(zhì)成分的變化，導(dǎo)致滅菌質(zhì)量不可控，影響臨床療效。本研究中從微生物含量、去氫二異丁香酚含量、總黃酮含量、HPLC圖的相似度4個角度評價滅菌效應(yīng)，可確保微生物控制水平符合2020 年版《中國藥典》規(guī)定，也能全面評價中藥物質(zhì)成分的變化，為中藥材的滅菌效應(yīng)評價提供參考。

3.3 研究的實用性

本研究中模擬生藥打粉、鋁箔袋密封、運(yùn)輸并輻照滅菌，并根據(jù)《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》［16］，設(shè)定最高輻照劑量為10 kGy。不足之處，不同產(chǎn)地、生產(chǎn)廠家的肉豆蔻藥材的固有微生物數(shù)量和種群、產(chǎn)品自身的水分和密度、外包裝、輻照設(shè)備的劑量等因素均會影響輻照的滅菌效果；在實際貯藏過程中，中藥材由于原料加工方法和環(huán)境衛(wèi)生狀況不同，初始微生物含量也有所差異［17］。故在進(jìn)行大批量產(chǎn)業(yè)化輻照處理時，應(yīng)根據(jù)原藥材的加工、儲存條件、包裝條件及其初始微生物的總數(shù)來確定合適的輻照劑量。

綜上所述，不同劑量電子束輻照對肉豆蔻藥材質(zhì)量無顯著影響，且輻照劑量達(dá)8 kGy時滅菌效果良好。