劉亮亮，孫 紅，武林芝，安 琪

（山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，山西 晉中 030619）

黨參始載于《本草從新》，為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參Codonopsistangshen Oliv. 的干燥根［1］，其性平、味甘，歸脾、肺經(jīng)，有健脾益肺、養(yǎng)血生津功效［2-3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黨參具有調(diào)節(jié)血糖、增強機體免疫力和抗胃潰瘍等多種作用［4-7］。2019 年，黨參被列入藥食同源物質(zhì)試點名單［8］，黨參藥材飲片需求量也大幅增加，同時對其質(zhì)量規(guī)范性提出了更高要求。目前，黨參藥材飲片等級劃分標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，導(dǎo)致市售品質(zhì)量參差不齊。2020 年版《中國藥典（一部）》對其的規(guī)定僅有鑒別、檢查和浸出物等項［1］，質(zhì)量控制的研究多以測定其中某個或幾個成分的含量為主［9-10］，高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜質(zhì)量評價也主要是針對某一特定地區(qū)藥材，如嶺南特色飲片熟黨參及其生品的研究［11］。有研究采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)實現(xiàn)了對黨參藥材及其炮制品的全面綜合評價［12-13］，但缺乏對市售黨參藥材飲片質(zhì)量的研究。中藥指紋圖譜為現(xiàn)代質(zhì)量控制模式，能整體表征中藥質(zhì)量［14-16］。中藥化學(xué)模式識別解決了中藥質(zhì)量多維信息的綜合分析問題，能更全面地體現(xiàn)中藥的內(nèi)在品質(zhì)［17-19］。鑒于此，本研究中采用HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法（含聚類分析和主成分分析）對太原市市售不同廠家29批黨參藥材飲片質(zhì)量進行了綜合評價，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；1000Y 型藥材粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；LK/CSJ-30型超聲波清洗機（成都老肯醫(yī)療科技股份有限公司）；XPE105型電子天平、XSE204型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度分別為0.01 mg和0.1 mg）；Fresco 21型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 試藥

黨參炔苷對照品（天津諾爾醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號1506567，含量99.21%）；黨參苷Ⅰ對照品、黨參炔苷寧對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號分別為CHB180123，CHB200721，含量≥98%）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為娃哈哈純凈水。太原市市售黨參藥材飲片29 批（來源信息見表1，除S5，S19，S21 樣品產(chǎn)地為山西省外，其余樣品產(chǎn)地均為甘肅?。?，經(jīng)山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院楊翠玲副教授鑒定為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula的干燥根。

表1 太原市市售29批黨參藥材飲片樣品信息Tab.1 Information of 29 batches of commercial Codonopsis Radix Decoction Pieces in Taiyuan

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立與相似度評價

2.1.1 色譜條件

色譜柱：WatersXSelect?HSST3柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.5%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min 時5%B → 10%B，20～70 min 時10%B →30%B，70～100 min 時30%B →60%B，100～115 min 時60%B →85%B，115～120 min 時85%B →95%B）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：220 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取黨參苷Ⅰ對照品8.77 mg，黨參炔苷寧對照品8.43 mg，黨參炔苷對照品9.45 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，分別加適量甲醇溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為1.75，1.69，1.89 mg/mL的單一對照品貯備液；各精密量取適量，用50%甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為100.0，200.0，400.0μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：將樣品粉碎，過3 號篩，取粉末2 g，精密稱定，平行2份，置150 mL具塞錐形瓶中，加入90%甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W、頻率50 kHz，下同）提取30 min，取出，室溫冷卻，再次稱定質(zhì)量，用90%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取1.5 mL，置2 mL離心管中離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

精密度試驗：取供試品溶液適量，按2.1.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，以黨參炔苷峰為參照峰，記錄峰面積和保留時間。結(jié)果各成分色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液適量，于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以黨參炔苷峰為參照峰，記錄峰面積和保留時間。結(jié)果各成分色譜峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品粉末2 g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以黨參炔苷峰為參照峰，記錄峰面積和保留時間。結(jié)果各成分色譜峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 指紋圖譜建立

取29 批樣品粉末，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖；將色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版），以編號S1樣品的色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)為0.1 min，采用多點校正自動匹配，采用中位數(shù)法生成對照圖譜（R），建立黨參藥材飲片HPLC 指紋圖譜的共有模式。29 批樣品的疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜分別見圖1 和圖2。共標(biāo)定18 個共有峰，比對后指認(rèn)出其中3個，分別為黨參苷Ⅰ峰（7號峰）、黨參炔苷寧峰（10 號峰）和黨參炔苷峰（11 號峰）。黨參炔苷為黨參中主要藥效成分，且峰面積較大、保留時間適中，故作為參照峰（s），將參照峰的保留時間和峰面積記為1，得各批樣品色譜峰相對保留時間的RSD為0.1%～0.8%，相對峰面積的RSD為19.0%～90.3%，表明不同批次樣品化學(xué)成分含量差異較大。

圖1 29批黨參藥材飲片高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

圖2 黨參藥材飲片高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.1.5 相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）評價29批樣品的相似度，結(jié)果見表2。28批樣品（S7除外）與對照指紋圖譜相似度為0.853～0.974，表明太原市市售黨參藥材飲片一致性較好。由圖1 可見，28 批樣品化學(xué)成分基本一致，僅含量有差異，其中4號峰（未鑒定出）和7，10，11 號峰為含量較高的主要色譜峰。S7 樣品中這4個成分的含量明顯低于其他樣品，是導(dǎo)致相似度較低的主要原因。

表2 29批黨參藥材飲片相似度評價結(jié)果Tab.2 Results of similarity evaluation of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.2 化學(xué)計量學(xué)分析

2.2.1 聚類分析

以18個共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件，選擇平方歐式距離測度進行聚類分析，聚類方法采用組間連接，聚類結(jié)果見圖3。當(dāng)分類距離為5時，29 批樣品可聚為3 類，其中S4，S14，S16 - S21，S23 -S24，S27 - S29 聚為一類，S1 - S3，S5 - S6，S8 - S13，S15，S22，S25 - S26 聚為一類，S7 單獨聚為一類。產(chǎn)地相同、廠家一致且相似度接近的樣品被聚為一類，如來自河北一達藥業(yè)有限公司的樣品S9，S11，S22，S25，安國市廣濟堂藥業(yè)有限公司的樣品S8，S15，S26被聚為一類，從而可較好地區(qū)分質(zhì)量存在差異的樣品。

圖3 29批黨參藥材飲片聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.2.2 主成分分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對29 批樣品的18 個共有峰峰面積進行主成分分析，特征值與方差貢獻率結(jié)果見表3，成分特征值碎石圖見圖4。以提取特征值大于1為原則，可得到5 個主成分因子，其累計方差貢獻率達84.175%（＞80%），故可將樣品的18個成分簡化為5個主成分進行分析。

表3 樣品共有峰峰面積主成分分析結(jié)果Tab.3 Results of PCA of common peak area of samples

為使上述提取的主成分更清晰全面地反映樣品原始數(shù)據(jù)所含信息，以最大方差法對變量進行正交旋轉(zhuǎn)，得到旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣（表4）。以5 個主成分因子為變量繪制載荷圖（圖5）。載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大［20］。1-4、9-11，5-8、12，1、13-14，15-16，17-18分別在主成分1，2，3，4，5上有相對較高的載荷，以29 批樣品的18 個共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，采用非監(jiān)督模式識別方法進行主成分分析，結(jié)果29批樣品可分為3組，與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖5 主成分載荷圖Fig.5 Loading plot of PCA

表4 旋轉(zhuǎn)后公共因子載荷矩陣表Tab.4 Public factor loading matrix after rotation

為綜合評價太原市市售黨參飲片的整體質(zhì)量，根據(jù)相應(yīng)主成分的權(quán)重系數(shù)計算綜合得分（得分越高，表明樣品整體質(zhì)量越好），并據(jù)此對不同批次樣品質(zhì)量排序［21］。詳見表5 和圖6。由表5 可知，不同批次樣品綜合得分差異較大，其中S19 樣品綜合得分最高，S7 樣品綜合得分最低。通過聚類與綜合得分結(jié)果整體分析，第一類（S1等）樣品質(zhì)量最優(yōu)，第二類（S4等）樣品質(zhì)量次之，第三類（S7）樣品質(zhì)量最差。

圖6 29批黨參藥材飲片的主成分得分圖Fig.6 PCA scoring plot of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

表5 29批黨參藥材飲片主成分得分、綜合得分及排名Tab.5 Score，comprehensive score and rank of principal components in 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

預(yù)試驗中分別以不同體積分?jǐn)?shù)甲醇（100%，50%，70%，90%），乙醇（90%，100%，50%，70%）為提取溶劑，結(jié)果顯示，提取溶劑為90%甲醇時，提取成分較多且主要色譜峰含量較高；對超聲時間（15，30，45 min）和超聲溶劑體積（15，30，45 mL）進行了考察，結(jié)果超聲溶劑體積為30 mL、超聲提取30 min效果較好。

3.2 色譜條件考察

預(yù)試驗中對供試品溶液進行全波長掃描（190～400 nm），結(jié)果顯示，在220 nm 波長處色譜峰數(shù)量較多、響應(yīng)值較高且色譜峰峰形較好，故選擇220 nm 為檢測波長；考察了Agilent Zorbax Eclipse Plus、Agilent Zorbax StableBond和Waters XSelect?HSS T3這三類色譜柱（規(guī)格均為250 mm × 4.6 mm，5 μm），結(jié)果HSS T3 色譜柱對極性較大的化合物有相對較好的保留，且在較短的分析時間內(nèi)實現(xiàn)目標(biāo)化合物的較好分離；考察了流動相中不同添加劑（甲酸和磷酸）及其不同體積分?jǐn)?shù)（0.1%磷酸、0.2%磷酸和0.5%磷酸）對色譜分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.5%磷酸水溶液為流動相時基線相對平穩(wěn)，分離良好；考察了不同柱溫（30，35，40 ℃）對結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，分離度隨柱溫升高顯著改善，分析時間縮短，但柱溫為40 ℃時反而影響分離度，故柱溫選擇35 ℃；考察了不同流速（1.0，1.2，1.5 mL/min）對結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流速提高，分析時間縮短，但影響色譜峰分離，故選擇流速為1.0 mL/min。

3.3 結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，太原市市售黨參藥材飲片化學(xué)成分一致性較好（S7 樣品除外），29 批樣品可聚為3 類。綜合得分排序結(jié)果表明，同一產(chǎn)地不同廠家樣品存在質(zhì)量差異，同一廠家不同批次樣品質(zhì)量也有優(yōu)劣之分。主成分分析是在盡可能保持原有數(shù)據(jù)信息的前提下，通過降維處理的方法達到簡化評價指標(biāo)的目的。本研究中共得到5 個主成分，其中色譜峰1 - 4、9 - 11，5-8、12，1、13-14，15-16，17-18對各個主成分的貢獻較大，是導(dǎo)致太原市市售黨參藥材飲片質(zhì)量差異的主要成分，峰面積較大的色譜峰4 是影響S7 樣品質(zhì)量的主要色譜峰之一，但色譜峰3，4，8，10，16，18 在本研究中尚未得到指認(rèn)，該部分相關(guān)性研究仍需借助液質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等手段進一步確認(rèn)，方可作為市售黨參藥材飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)。后續(xù)研究將建立質(zhì)量控制指標(biāo)含量測定方法，進一步加強黨參藥材飲片質(zhì)量控制，以保證產(chǎn)品的均一性。同時，本研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)地對黨參藥材飲片質(zhì)量優(yōu)劣也有重要影響，故需擴大不同產(chǎn)地樣本量進一步考察產(chǎn)地對市售黨參飲片的影響，以更全面地為黨參藥材飲片的質(zhì)量研究提供參考。

綜上所述，本研究中將指紋圖譜、聚類分析及主成分分析結(jié)合，可全面評價市售黨參藥材飲片的質(zhì)量，為其質(zhì)量的規(guī)范性研究提供了參考。