海 月，朱 敏，錢 芳，陸 超，吳 磊，束雅春

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210036）

中藥粉末飲片是飲片的重要臨床應(yīng)用形式之一，《中國藥典》以及各省、自治區(qū)、直轄市中藥飲片炮制規(guī)范中收載的中藥粉末飲片日益增多，中藥粉末飲片具有提高有效利用率、節(jié)省藥材資源、配伍靈活、可避免處方外泄等特點而得到廣泛應(yīng)用［1-2］。中藥粉末飲片用量逐年增加，但我國并未對其適用范圍、適宜粒徑、制備工藝、質(zhì)量控制等內(nèi)容作出詳細規(guī)定和制訂統(tǒng)一標準，難以保障其質(zhì)量，制約了中藥飲片產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展［3］。因此，加強中藥粉末飲片的生物等效性、安全性和提取工藝研究是創(chuàng)新中藥飲片用藥形式的關(guān)鍵。核苷類化合物是維持生物細胞重要功能的一類成分，生理作用和生物活性廣泛，如抗癌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性等［4-9］。本研究中以白扁豆和瓜蔞子兩味中藥的粉末飲片為例，考察不同粉碎粒度、提取時間、提取次數(shù)對其中核苷類成分含量的影響，為粉末飲片的制備工藝和生物等效性研究提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華儀器制造有限公司）；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；AX224ZH/ E 型電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；5424R 型高速冷凍離心機（Eppendorf 公司）；e2695 - 2998 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

試藥：胞嘧啶對照品（批號為TW1128XA13）、尿嘧啶對照品（批號為T14A8X33880）、尿苷對照品（批號為TM0313XA13）、鳥苷對照品（批號為AJ0609NA14）、腺苷對照品（批號為Z04N8J47423），均購自上海源葉生物科技有限公司，含量≥98.0%；乙腈為色譜純，乙酸銨（10 mmol/L）為分析純，水為娃哈哈純凈水。白扁豆藥材飲片（安徽亳州永剛飲片廠，批號為A220315）；瓜蔞子藥材飲片（貴州同德藥業(yè)有限公司，批號為20220101-01）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK ADME - HR（S - 5）柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-10 mmol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～15 min時1%A →5%A，15～25 min 時5%A，25～28 min 時5%A →80%A，28～33 min 時80%A；33～35 min 時80%A →1%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥苷和腺苷對照品各適量，精密稱定，分別加10%甲醇溶解，制成每1 mL分別含0.535，0.500，0.498，0.539，0.590 mg的單一對照品貯備液；分別取適量，混合后加10%甲醇定容，制成每1 mL 分別含0.107，0.100，0.099，0.108，0.118 mg的混合對照品溶液。

供試品溶液：稱取原飲片（白扁豆A，瓜蔞子GA）及粉末飲片［未過1 號篩（白扁豆B，瓜蔞子GB），過1 號篩（白扁豆C，瓜蔞子GC），過2 號篩（白扁豆D，瓜蔞子GD）、過3 號篩（白扁豆E，瓜蔞子GE）］5 種粒度飲片各2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加熱水20 mL，密塞，搖勻，浸泡30 min 后，分別煎煮10，20，30 min（編號分別為①②③），煎煮1 次（Ⅰ）或2 次（Ⅱ），搖勻濾過后，濾液置10 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上清液900μL，加甲醇定容至1 mL，經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。白扁豆、瓜蔞子供試品編號見表1。

表1 2種藥材粉末飲片供試品編號（n=2）Tab.1 Numbers of test solution of two medicinal powder decoction pieces（n=2）

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2項下溶液各10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，供試品溶液與混合對照品溶液在相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，且分離度均大于1.5，分離良好。理論板數(shù)按各成分峰計均大于3 000。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，配成不同質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test

檢測限與定量限考察：分別取胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥苷和腺苷的單一對照品溶液適量，倍比稀釋后按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）約為3和10 時各待測成分質(zhì)量濃度分別記作檢測限和定量限。結(jié)果各成分的檢測限分別為0.01，0.01，0.03，0.01，0.02 μg，定量限分別為0.03，0.04，0.08，0.04，0.07μg。

精密度試驗：取2.1 項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.72%，0.72%，0.71%，0.71%，0.72%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下E③Ⅰ、GE③Ⅰ供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，18，24 h時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果E③Ⅰ供試品溶液中胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.73%，0.60%，1.21%，1.50%（n= 8），GE③Ⅰ供試品溶液中胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.80%，0.66%，1.22%，1.20%，1.03%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取2.2項下E③Ⅰ、GE③Ⅰ樣品適量，各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算各成分含量。結(jié)果E③Ⅰ供試品溶液中胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、腺苷含量的RSD分別為0.72%，1.30%，1.24%，0.65%（n= 6），GE③Ⅰ供試品溶液中胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷含量的RSD分別為0.93%，0.56%，0.70%，1.44%，1.07%（n=6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗：取已知含量的白扁豆和瓜蔞子粉末飲片樣品，各6 份，每份2 g，精密加入各單一對照品貯備液，按2.2項下方法制備E③Ⅰ和GE③Ⅰ的供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果見表3和表4。

表3 白扁豆藥材粉末飲片樣品加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test of Lablab Semen Album Powder Decoction Pieces（n=9）

表4 瓜蔞子藥材粉末飲片樣品加樣回收結(jié)果（n=9）Tab.4 Results of the recovery test of Trichosanthis Semen Powder Decoction Pieces（n=9）

2.4 樣品含量測定

取2.2 項下各供試品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量，結(jié)果見表5和表6（“-”為未測出）。最終確定白扁豆、瓜蔞子藥材粉末飲片最佳工藝均為打成粗粉（后者需過2號篩），提取2次，每次20 min。

表5 白扁豆藥材粉末飲片樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.5 Results of content determination of nucleosides in Lablab Semen Album Powder Decoction Pieces（mg/g，n=2）

表6 瓜蔞子藥材粉末飲片樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.6 Results of content determination of nucleosides in Trichosanthis Semen Powder Decoction Pieces（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 提取方法選擇

預(yù)試驗中同時考察了超聲水提取法和加熱水提取法，結(jié)果顯示，前法對核苷類成分的溶出率更高，但考慮臨床實際使用時多是加熱水提取1 次或2 次，故最終仍選擇加熱水提取，提取時間選取10，20，30 min，提取次數(shù)按1次和2次分別進行考察。

3.2 色譜條件優(yōu)化

預(yù)試驗中同時考察了甲醇-水，甲醇-0.2%甲酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水溶液，乙腈-10 mmol/L乙酸銨5 種不同的流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，采用乙腈-10 mmol/L乙酸銨流動相系統(tǒng)時峰形更對稱，分離效果更好；還同時考察了Waters Sunfire C18柱，Zefex Acutfex PW-C18柱及CAPCELL PAK ADME-HR（S-5）柱，結(jié)果顯示，本研究中所選色譜柱在高水相比例下有較好的分離效果和耐用性。

3.3 測定結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，不同提取時間、提取次數(shù)及粒度對核苷類成分含量有不同程度的影響。白扁豆藥材粉末飲片樣品中檢測到胞嘧啶，尿嘧啶，尿苷和腺苷，瓜蔞子藥材粉末飲片樣品中除上述4種成分外，還檢測到鳥苷。白扁豆和瓜蔞子藥材粉末飲片各粒度樣品中，提取2次比提取1次的核苷類成分含量均增加。

白扁豆藥材粉末飲片樣品：各粒度樣品中均檢測到胞嘧啶和腺苷。樣品提取20 min 和30 min 的樣品中核苷類成分含量均明顯高于提取10 min，前兩者間含量差異不明顯；在相同提取時間和提取次數(shù)條件下，B 樣品中核苷類成分含量總體高于其他粒度，其次是粒度最小的E樣品，但在煎煮過程中，粒度太小易發(fā)生糊底。因此，綜合考慮本研究結(jié)果和臨床實際應(yīng)用操作便捷性，以打成粗粉，提取2次，每次20 min為宜。

瓜蔞子藥材粉末飲片樣品：在原飲片提取物中均未檢測到核苷類成分；在GB 樣品中僅在提取30 min 的樣品中檢測到部分核苷類成分；GC，GD，GE 樣品以提取2次樣品中大部分的核苷類成分含量較高，且以提取30 min 含量較高（但有部分核苷類成分含量反而低于20 min），GD樣品中核苷類成分含量總體偏高，臨床使用時，可考慮將瓜蔞子粉碎過2號篩，提取2次，每次20 min。

本研究結(jié)果顯示，隨著粉碎粒度的增加，核苷類成分的含量不完全隨之增加，可能由于果實種子類成分含油脂較多，粒度越小，油脂類成分的溶出也隨之增加，一定程度上會限制某些核苷類成分的溶出，可見臨床使用時，有效成分溶出率不一定與粒度呈負相關(guān)。本研究中，每個樣本均平行制備2 份，能一定程度上反映核苷類成分含量的變化趨勢，但重復(fù)次數(shù)仍有限，后續(xù)需對現(xiàn)有結(jié)果進行反復(fù)驗證。中藥發(fā)揮藥效是多成分共同作用的結(jié)果，核苷類只是其中的一類成分，白扁豆和瓜蔞子藥材飲片中含有大量的脂肪酸、蛋白質(zhì)等其他成分，粉碎粒度及提取方法的考察，尚需結(jié)合多成分多指標綜合評價。核苷類成分在白扁豆和瓜蔞子藥材飲片中的藥理藥效機制尚未知曉，后續(xù)還需結(jié)合相關(guān)評價指標，從功效相關(guān)活性成分的粉碎及提取工藝角度綜合完善果實種子類粉末飲片的煎煮規(guī)范，以更好地為臨床科學合理用藥提供研究依據(jù)。