王海珍　周婷婷　徐波

【摘要】? 目的? 通過動物實驗觀察葛根素在體外對大鼠成骨細胞增殖能力的影響，探討其臨床作用機理。方法 分離新生SD大鼠顱蓋骨成骨細胞（OB），將分離培養(yǎng)后的OB隨機分為7份，其中6份作為實驗組分別放入不同濃度（1×10-5mol/L～1×10-10mol/L）的葛根素培養(yǎng)基中；1份作為對照組放入不含葛根素的培養(yǎng)基中。觀察兩組成骨細胞放入7種不同培養(yǎng)基后不同時間點的細胞形態(tài)、貼壁、生長、吸光度（OD值）等情況。結(jié)果? 顯微鏡下可見，三代OB培養(yǎng)第7d，對照組中細胞形態(tài)呈現(xiàn)出多種不規(guī)整形狀；而實驗組中在葛根素濃度為1×10-10mol/L中細胞形態(tài)呈現(xiàn)出短梭形、三角形、多角形等，胞漿向外伸展；在葛根素濃度為1×10-7mol/L中細胞形態(tài)單一，呈長梭形，胞漿向外伸展。增殖柱狀圖顯示，培養(yǎng)3d后各組OB數(shù)量開始迅速增多，尤其是葛根素濃度達到1×10-7mol/L組，細胞增殖數(shù)量遠超過對照組和高濃度組，但此后隨葛根素濃度降低，細胞增殖數(shù)量有逐漸降低的趨勢。3d后葛根素濃度為1×10-7mol/L及以下組的OD均顯著升高（P<0.05）；而5d和7d時，葛根素濃度為1×10-5mol/L和1×10-6mol/L的實驗組OD值低于對照組（P<0.05）。表明當葛根素濃度在1×10-10mol/L至1×10-7mol/L范圍內(nèi)對OB均有促增值作用，且隨著濃度的增高作用增強，但濃度再高則有抑制增值作用。結(jié)論? 葛根素具有明顯促進大鼠成骨細胞增殖作用，其作用與葛根素的濃度有關(guān)，當葛根素的濃度為1×10-7mol/L對大鼠成骨細胞的促增殖作用最強。

【關(guān)鍵詞】? 葛根素；葛根異黃酮；成骨細胞增殖；骨修復

中圖分類號? R285.5? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）17--04

Effect of different puerarin concentrations on the proliferation of rat osteoblasts in vitro? Wang Haizhen， Zhou Tingting， Xu Bo. Hebei Rehabilitation Hospital， Qinhuangdao 066000， China

【Abstract】? Objective? To observe the effect of puerarin on the proliferation ability of rat osteoblasts in vitro through animal experiments， and explore its clinical mechanism of action. Method? To isolate osteoblasts from the skull cap of newborn SD rats， the isolated and cultured osteoblasts were randomly divided into 7 parts， of which 6 were used as experimental groups and placed in different concentrations （1×10-5 mol/ml～1×10-10mol/ml ）of puerarin medium; 1 serving as the control group was placed in a culture medium without puerarin. Observe the cell morphology， adhesion， growth， and absorbance （OD） of the two components of bone cells at different time points after being placed in 7 different culture media. Results? Under the microscope， it can be seen that on the 7th day of third-generation OB culture， the cell morphology in the control group showed various irregular shapes; In the experimental group， the concentration of puerarin was 1×10-10mol/L medium cells exhibit short spindle shaped， triangular， polygonal shapes， and the cytoplasm extends outward; When the concentration of puerarin is 1×10-7mol/L， the cell morphology is single， showing a long spindle shape， and the cytoplasm extends outward. The proliferation bar chart shows that after 3 days of cultivation， the number of OBs in each group began to rapidly increase， especially when the concentration of puerarin reached 1×10-7mol/L ， the number of cell proliferation was much higher than that of the control group and low concentration group. However， as the concentration of puerarin decreased， the number of cell proliferation gradually decreased. After 3 days， the concentration of puerarin is 1×10-7mol/L The OD of groups with concentrations of and below significantly increased （P<0.05）; At 5d and 7d， the concentration of puerarin is 1×10-5mol/L and 1×10-6mol/L. The OD value of the experimental group with was lower than that of the control group （P<0.05）. Indicates that when the concentration of puerarin is at 1×10-10mol/L to 1×10-7mol/L Within the range of ， there is a promoting effect on OB proliferation， and the effect increases with the increase of concentration. However， higher concentrations have an inhibitory effect on OB proliferation. Conclusion? Puerarin has a significant promoting effect on rat osteoblast proliferation， which is related to the concentration of puerarin. When the concentration of puerarin is 1×10-7mol/L has the strongest proliferative effect on rat osteoblasts.

【Key words】? ?Puerarin; Puerarin isoflavones; Osteoblasts; Bone repai

葛根，是豆科植物野葛干燥的根，習稱野葛，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主消渴，身大熱，嘔吐，諸痹，起陰氣，解諸毒。[1]其性甘、辛，涼，有解肌退熱，生津止渴，升陽止瀉，透疹之功，傳統(tǒng)醫(yī)學常用于表證發(fā)熱，熱病口渴，陰虛消渴，項背強痛，熱瀉熱痢，脾虛泄瀉，麻疹不透等癥。葛根及其制劑因療效確切已經(jīng)廣泛應用于臨床各科室。已有的研究證實，葛根素具有松弛平滑肌，起到解痙作用；具有松弛血管平滑肌，進而擴張冠脈，改善心肌供血，緩解心絞痛；葛根素干預細胞膜的離子轉(zhuǎn)運，進而起到抗心律失常以及降壓的作用；葛根素具有β-腎上腺素能受體拮抗作用，故而能減慢心率，降低外周阻力，改善心功能和心肌代謝。實驗發(fā)現(xiàn)葛根素有改善腎功、降糖、抗癌、調(diào)高機體免疫力、抗血小板聚集等諸多功效[2]。目前關(guān)于葛根在外科疾病系統(tǒng)的研究也有了新的進展，包括對成骨前體細胞增殖、骨質(zhì)疏松、骨折愈合的影響以及葛根素用于臨床修復骨細胞等[3-5]。目前人群2型糖尿病患者越來越多，據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界每3s即有1位糖尿病患者因足壞疽而截肢。糖尿病足除了常見的局部組織、神經(jīng)、血管壞死以外，多還伴有下肢末梢骨質(zhì)破壞[6]，高糖環(huán)境對骨質(zhì)具有破壞作用 [7]，因此不少患者在入院時由于已經(jīng)存在明顯足趾骨壞死的情況，而不得不面臨截肢的選擇。臨床實踐顯示，采用葛根制劑藥物的綜合治療，對糖尿病足骨組織的修復確實有一定作用，這種作用可能主要得益于其中的葛根異黃酮，此外有研究顯示葛根素亦有明顯抑菌作用[8]，可有效抑制患肢高糖環(huán)境下細菌的增殖，為骨修復提供良好的生長條件。本研究通過動物實驗，探討不同葛根素濃度在體外對大鼠成骨細胞的增殖修復作用[9]，為葛根素在骨損傷領域的應用提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 實驗動物

采用新生SD（sprague dawley）大鼠10只，雌雄不限，4周齡，平均體重105±5g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物均在22±3℃室溫、燈光12h交替，相對濕度50±5%的條件，實驗室清潔衛(wèi)生，保持自然光照及空氣流通，全程大鼠置于鼠籠中飼料喂養(yǎng)。實驗過程及處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》要求。

1.2? 主要藥品與試劑

（1）主要藥品：葛根素（100mg/支）（北京四環(huán)科寶制藥有限公司），青霉素、鏈霉素（80萬u）（華北制藥廠），胰蛋白酶、低糖DMEM干粉（Gibco公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（中國醫(yī)學科學院血液病研究所科技公司），PBS緩沖液（北京譜析科技有限公司）。

（2）主要試劑及配置方法：骨消化液（含10g/LⅡ型膠原酶，2.5g/L胰蛋白酶），0.25%胰酶（0.25g胰酶溶解于100ml PBS緩沖溶液中，0.22?m濾膜除菌分裝，－20℃保存，4℃溶解），雙抗（80萬u青霉素、鏈霉素，80ml超純水混勻，0.22?m濾膜過濾分裝，－20℃保存，4℃溶解），普通完全培養(yǎng)基（DMEM干粉、NaHCO3、超純水充分混勻溶解，PH值在7.0～7.2間，0.22?m濾膜除菌分裝，4℃保存。用前加雙抗、FBS，青霉素、鏈霉素濃度分別為每毫升含100u；FBS濃度為10%），cck-8試劑盒（Cell Counting Kit-8）（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

（3）主要儀器： CO2培養(yǎng)箱；超凈臺（forma scientific company），倒置相差顯微鏡（Nikon公司），超純水器（杭州永潔達凈化科技有限公司），低溫高速離心機（Sigma-SK），酶免疫檢測儀（BIO-RAD公司）。

1.3? 實驗方法

1.3.1? 成骨細胞提取及傳代? 無菌環(huán)境取大鼠顱蓋骨，PBS緩沖液清洗3遍，去凈軟組織，剪碎骨片，骨片大小約1mm×1mm×1mm，先用8倍于骨碎片體積的胰蛋白酶，于37℃水浴中預消化20min，去上清液，然后用PBS緩沖液清洗3次，再用8倍于骨碎片體積的骨消化液，于37℃水浴中繼續(xù)消化2遍，每次1h，收集消化液，離心棄上清。所得白色沉淀物即為成骨細胞（osteoblast，OB）樣細胞團。用含體積分數(shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，吹打均勻后通過篩網(wǎng)成單層細胞懸液，并按2×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、含體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。48h后全量換液棄去懸浮細胞，后每隔2d換液1次。待80%～90%原代細胞融合成單層，即進行傳代培養(yǎng)。將OB用PBS液沖洗3次，0.25%胰酶1ml放入CO2孵箱中消化1～2min，在倒置相差顯微鏡下觀察，待細胞收縮、變圓，少量脫壁后放入完全培養(yǎng)基，充分吹打制成單細胞懸液，按1∶3比例傳代培養(yǎng)，取第3代細胞進行實驗。

1.3.2? 成骨細胞分組處理? 取生長狀態(tài)良好的第三代OB隨機分為7份，其中6份作為實驗組分別放入6種不同濃度的葛根素培養(yǎng)基中；1份作為對照組放入培養(yǎng)液為單純含5%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中。將上述兩組細胞以6×103/孔的密度將其接種于96孔板，24h后去培養(yǎng)液，兩組培養(yǎng)基分別置于37℃+5%CO2孵箱培養(yǎng)，隔2d換1次液。分別在細胞培養(yǎng)過程中的第1，3，5，7d取一塊96孔培養(yǎng)板，在倒置相差相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、貼壁、生長情況并拍照。然后PBS緩沖液清洗2次，每孔加入100?l的含cck-8液的培養(yǎng)基（100?l/ml）液，37 ℃+5% CO2 培養(yǎng)箱孵育3h，振蕩10min后用酶免疫檢測儀測定各孔光吸收值（optical delnsity，OD值）。

1.4? 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，計量資料采用“均數(shù)±標準差”表示，同一時點不同OD值的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1? 不同濃度的葛根素OB形態(tài)比較

倒置相差顯微鏡下觀察OB在對照組與實驗組中的形態(tài)變化，結(jié)果顯示，三代OB培養(yǎng)第7d，對照組中細胞形態(tài)呈現(xiàn)出多種不規(guī)整形狀；而實驗組中在葛根素濃度為1×10-10mol/L中細胞形態(tài)呈現(xiàn)出短梭形、三角形、多角形等，胞漿向外伸展；在葛根素濃度為1×10-7mol/L中細胞形態(tài)單一，呈長梭形，胞漿向外伸展，具體見圖1～圖3。

2.2? 不同濃度的葛根素OB生長曲線比較

增殖柱狀圖顯示，培養(yǎng)3d后各組OB數(shù)量開始迅速增多，尤其是葛根素濃度達到1×10-7mol/L組，細胞增殖數(shù)量遠超過對照組和高濃度組，但此后隨葛根素濃度降低，細胞增殖數(shù)量有逐漸降低的趨勢，見圖4。

2.3? 不同濃度的葛根素OD值比較

試驗第1d，各組間OD值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。試驗后第3、5、7d，組間OD值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與對照組比，3d后葛根素濃度為1×10-7mol/L及以下組的OD 均顯著升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其中均以1×10-7mol/L濃度組的OD值最高；而5d和7d時，葛根素濃度為1×10-5mol/L和1×10-6mol/L的實驗組OD值低于對照組，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。表明當葛根素濃度在1×10-10mol/L至1×10-7mol/L范圍內(nèi)對OB均有促增殖作用，且隨著濃度的增高作用增強，但濃度再高則有抑制增殖作用，見表1。

3? 討論

本實驗研究證實，葛根素濃度對成骨細胞的增殖有影響，當葛根素濃度在1×10-10mol/L～1×10-7mol/L范圍內(nèi)，細胞生長、貼壁、吸光度（OD值）最高，且呈現(xiàn)出明顯劑量依賴性。

目前已有的研究證實，藥物雌激素有明確促進成骨的作用，它的作用機制主要是通過受體途徑促進破骨細胞凋亡，同時促進OB的Bcl-2等抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出對OB抗凋亡作用，進而促進OB的增殖、分化和功能表達[10]。藥物雌激素又可同帕米磷酸二鈉、降鈣素等作為骨吸收的抑制藥，用于諸如骨質(zhì)疏松癥、骨折后修復等骨科疾病的治療[11]。目前藥物雌激素療效肯定并且價錢經(jīng)濟實惠，故臨床應用較為廣泛。但長期應用藥物雌激素有很多負面作用，比如增加惡性疾病患病的風險。近年來美國婦產(chǎn)科學會已經(jīng)開始修訂藥物雌激素替代藥物的使用準則，未來臨床醫(yī)生們應用藥物雌激素將更為慎重。因此尋求一些既有雌激素樣作用，又無其副作用的替代物一直是醫(yī)生及學者們共同關(guān)注的問題。葛根素中的葛根異黃酮屬于天然雌激素，在擁有藥物雌激素治療作用的同時少了其明顯的毒副作用，故而成為我們關(guān)注的重點[12]。

本實驗的研究證明，葛根素確有明顯修復大鼠骨損傷的作用，其主要作用機理極有可能是葛根素中葛根異黃酮的功效，當然尚不能排除葛根素中的其他成分與葛根異黃酮的協(xié)同治療作用，比如目前證實的葛根素還有修復血管，降低血脂的功效[13]，這顯然并非是葛根異黃酮的作用，而是葛根素中其他物質(zhì)或多種成份綜合在一起的作用，而這些功效可能對改善OB的自我修復環(huán)境是有益的，其具體作用機制還待進一步研究。然而葛根素應用于骨損傷的修復很可能成為未來骨損傷修復的新途徑。

葛根素作為藥物并不是完全安全的，目前偶有葛根素制劑不良反應的報道[14]，如出現(xiàn)溶血性黃疸、溶血性貧血、陣顫、甚至休克[15]，如何做到安全、合理、有效地利用葛根這一中藥資源，仍需深入研究探索。

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[2023-08-16收稿]