梁滿 孟維偉 陳志德 沈一 劉永惠 沈悅 劉柱 南鎮(zhèn)武 徐杰 張正

摘要：本試驗(yàn)通過16S rRNA基因測序技術(shù)，研究零氮（0 kg/hm2）、低氮（75 kg/hm2）、中氮（150 kg/hm2）和高氮（225 kg/hm2）4個氮肥梯度對花生根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，施氮可以提高花生根際土壤微生物群落的豐富度和多樣性，不同氮肥處理中以中氮處理的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)最高。施氮處理下的OTUs個數(shù)均多于不施氨，且隨著氮肥施人量的增加呈先升高后降低的趨勢，中氮處理較零氮、低氮和高氨分別高11.21%、4.90%和7.01%。不施氮和在一定施氮范圍內(nèi)，土壤微生物群落穩(wěn)定，但是高氮會導(dǎo)致土壤微生物群落不穩(wěn)定。16S rRNA功能預(yù)測分析顯示，施氮處理下的細(xì)胞運(yùn)動等功能基因的豐度相對升高，對花生根際土壤微生物群落的功能豐度譜產(chǎn)生一定的影響。本研究明確了施氮對花生根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，為深入研究不同施肥措施對花生根際微生態(tài)的影響提供了借鑒。

關(guān)鍵詞：花生根際；施氨水平；土壤微生物群落功能多樣性；16S rRNA

中圖分類號：S565.2：S154.34 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0078-06

花生是我國重要的油料作物，也是重要的植物油脂和蛋白質(zhì)來源。氮是花生吸收量最大的營養(yǎng)元素，增施氮肥能提高花生產(chǎn)量、改善花生品質(zhì)。此外，地下部微生物群落也受到氮肥的影響。土壤氮水平是影響根際微生物的重要因素，對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)，氮肥的施用可以提高土壤微生物群落碳源利用率、微生物群落的豐富度和功能多樣性。付智丹等發(fā)現(xiàn)適宜的施氮量不僅能夠增加玉米、大豆套作土壤中的真菌、放線菌和固氮菌的數(shù)量，還能調(diào)節(jié)土壤氮素的轉(zhuǎn)化。趙帆等發(fā)現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)受多種土壤環(huán)境因子的影響，以土壤全氮含量和pH值對微生物群落的影響最顯著。丁紅等發(fā)現(xiàn)在于旱低氮雙重脅迫下，花生根際細(xì)菌可能在花生生長和響應(yīng)逆境脅迫中起重要作用。然而，目前關(guān)于氮肥用量和微生物類群之間的關(guān)系仍未明確，不同施氮量對花生土壤微生物群落的影響還缺乏系統(tǒng)研究。

本試驗(yàn)探究不同施氮水平對花生根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的影響，預(yù)測細(xì)菌群落功能，以期為花生建立合理的施肥制度和提高氮肥利用率提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)陽試驗(yàn)基地進(jìn)行，土壤類型為潮土，質(zhì)地沙壤，0-20cm土層有機(jī)質(zhì)含量為12.3g/kg，全氮0.5 g/kg，堿解氮52.8 mg/kg，速效磷93.1 mg／kg，速效鉀10.2 mg/kg，鹽分0.21％，pH 7.3。

供試花生品種為花育25號，壟作種植，壟底寬80 cm，壟面寬40 cm，壟上播2行花生，行距35cm，穴距18 cm，每穴2株。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個處理：NO（零氮，0 kg/hm2）、Nl（低氮，75 kg/hm2）、N2（中氮，150 kg/hm2）、N3（高氮，225 kg/hm2）。3次重復(fù)。磷肥為P2O5120 kg/hm2、鉀肥為K2O 120 kg/hm2，均作底肥一次性施入。

1.3根際土壤采集

于花生結(jié)莢期將整株挖出，抖落根系表層土壤，用滅菌刷子將根際1～10 mm的土壤拂刷下來放入無菌袋中，同一處理的花生根際土壤樣品混合成一個土壤樣品，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存。相關(guān)測試由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.4測定方法

根據(jù)OMEGA Soil DNA Kit試劑盒（USA）說明書進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測，NanoDrop ND-2000核酸蛋白測定儀分析檢測DNA的濃度和純度。以提取的土壤樣本DNA為模板，對土壤細(xì)菌16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物為V3-V4區(qū)的343F（5-TACGGRAGGCAGCAG -3'）以及798R（5-AGGGTAT CTAATCCT-3'）。PCR擴(kuò)增體系（20uL）：預(yù)混液10 uL，正、反向引物（10 umol/L）各0.8 uL，DNA模板（10 ng）1 uL，ddH2O補(bǔ)足至20uL。擴(kuò)增程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán)：72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，采用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，UnionCity，USA）進(jìn)行純化，利用QuantiFluorTM -ST（Promega，USA）進(jìn)行定量和Illumina公司的MiseqPE300平臺進(jìn)行測序。

1.5生物信息學(xué)分析

采用Alpha多樣性分析方法，對樣本間的主成分進(jìn)行分析（PCA），以挖掘花生根際土壤細(xì)菌群落組成的差異?；贕reengenes數(shù)據(jù)庫注釋的16S rRNA測序數(shù)據(jù)，使用PICRUSt軟件預(yù)測已知微生物基因功能的構(gòu)成，從而統(tǒng)計(jì)不同樣本和分組之間在功能上的差異。

2結(jié)果與分析

2.1土壤微生物群落豐富度和多樣性變化

由表1可以看出，各處理間覆蓋度無顯著差異，平均值均在0.95以上，土壤樣本文庫覆蓋率較高。施氮處理下的Observed species指數(shù)和Chao 1指數(shù)均高于不施氮處理，且均隨氮肥施入量的增加呈先升高后降低的趨勢，其中N1和N2的Observed species指數(shù)差異不顯著，但顯著高于NO和N3，Chao 1指數(shù)以N2處理最高。Shannon指數(shù)隨著施氮量的增加先增加后減少，在N2處理達(dá)到最大值；施氮處理下的Simpson指數(shù)差異不顯著，但均低于不施氮處理，說明施氮處理群落物種分配不均勻，多樣性高。表明施氮可以提高花生根際微生物群落的豐富度和多樣性，不同施氮水平以N2處理最優(yōu)。

2.2土壤微生物群落組成分析

圖1可見，在門分類水平上，各處理中根際土壤細(xì)菌群落排名前5位的優(yōu)勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria，41.41％～47.50％）、放線菌門（Actinobacteria，15.76％-16.80％）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，12.34％～15.04％）、擬桿菌門（Bacteroidetes，11.81％-15.38％）和厚壁菌門（Firmicutes，4.87％-5.18％）。在優(yōu)勢菌門中，施氮處理下的變形菌門和放線菌門的相對豐度均高于不施氮處理，其中變形菌門相對豐度以N2處理最高，放線菌門的相對豐度在N1和N2處理下差異不顯著，但均高于N3處理，說明花生根際土壤微生物群落的優(yōu)勢菌門相對豐度并沒有隨著施氮量的增加而一直增多。施氮量對其它3種優(yōu)勢菌群（芽單胞菌門、擬桿菌門和厚壁菌門）的相對豐度影響不大。

2.3土壤微生物群落OTUs聚類分析

如圖2所示，所有處理中共有的OTUs為1 385。在97％的相似度下，NO、N1、N2、N3各處理分別平均獲得2 445、2 592、2 719、2 541個OTUs，3種施氮處理下的OTUs數(shù)均多于不施氮，且隨著氮肥施人量的增加呈先升高后降低的趨勢．其中N2處理較NO、N1和N3高11.21％、4.90％和7.01％。表明，施氮可以提高花生根際微生物群落的OTUs數(shù)。

2.4土壤微生物群落主成分分析

如圖3所示，橫坐標(biāo)（PCl）能夠解釋12.6％的樣本差異，縱坐標(biāo)（PC2）能夠解釋11.4％的樣本差異。聚類分析表明，同一處理3次重復(fù)聚集到同一分支，不同處理樣本間距離較遠(yuǎn)，差異較大，聚集于不同分支。PC1將NO和N1與N2和N3明顯區(qū)分，NO處理全部分布在PC1的負(fù)方向，N2和N3處理分布在PC1的正方向，而N1處理在PC1正負(fù)方向上均有分布。PC2將N3處理與NO、N1和N2明顯區(qū)分，N3處理全部分布在PC2的負(fù)端，NO、N1和N2處理主要出現(xiàn)在PC2的正端。說明施氮影響了花生根際土壤環(huán)境，使根際土壤細(xì)菌群落多樣性產(chǎn)生較大差異。從圖3還可以看出，NO、N1和N2處理得分系數(shù)離散小，N3處理得分系數(shù)變異較大，這一研究結(jié)果表明，不施氮和在一定施氮范圍內(nèi)，土壤微生物群落穩(wěn)定，但是過量施入氮肥會導(dǎo)致土壤微生物群落不穩(wěn)定。

2.5土壤微生物群落潛在功能預(yù)測

如圖4所示，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（amino acid transport and metabolism）、轉(zhuǎn)錄（transcription）、信號傳導(dǎo)（signal transduction mechanisms）、細(xì)胞壁／膜／包膜生物發(fā)育（cell wall/membrane/envelope biogenesis）、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化（energy production and conversion）和碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（carbo-hydrate transpon and metabolism）這6類功能所占的比重較大。與不施氮相比，施氮處理下的細(xì)胞運(yùn)動（cell motility）、細(xì)胞骨架（cytoskeleton）和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸（intracellular trafficking，secretion，and vesicular transport）等功能基因的豐度相對升高，說明花生根際土壤細(xì)菌群落在適量氮素的調(diào)控下會產(chǎn)生較高的活性。

3討論

根際是植物根系與土壤微生物之間相互作用所形成的微生態(tài)環(huán)境，在植物生長和發(fā)育過程中起著重要作用，根際微生物作為根際的重要組成部分，其群落多樣性反映群落總體的動態(tài)變化?？茖W(xué)的肥料管理通過影響土壤微生物量和菌群結(jié)構(gòu)，從而在一定程度上改變土壤養(yǎng)分和作物產(chǎn)量。本研究顯示，施氮可以提高花生根際微生物群落的豐富度和多樣性，其中150kg/hm2氮肥施用量的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)最高。聶江文等研究湖南雙季稻區(qū)微生物群落發(fā)現(xiàn)，在冬種紫云英不還田條件下配施氮肥處理的多樣性指數(shù)以及物種豐富度指數(shù)均高于不施氮。謝文軍、覃瀟敏等發(fā)現(xiàn)，施用無機(jī)化肥可以提高土壤微生物的Shannon指數(shù)。說明土壤氮水平對土壤微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)有一定的影響，本研究發(fā)現(xiàn)中氮處理下的土壤微生物活性最佳，高氮處理對微生物的活性產(chǎn)生抑制作用。

秸稈還田及配施氮肥條件下，水稻田根際土壤中優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等，干旱脅迫和低氮處理下花生根際土壤中的變形菌門相對豐度降低。本研究中，各根際土壤細(xì)菌群落的處理中排名前5位的優(yōu)勢菌門分屬變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，其中，變形菌門相對豐度以中氮處理最高，說明變形菌門在低氮條件下的相對豐度較低，這與丁紅等的研究結(jié)果一致。施肥對土壤微生物群落的影響存在一定的不確定性，白震等發(fā)現(xiàn)不同配施會抑制黑土中大多數(shù)菌群的生長，但在氮肥優(yōu)化條件下，能提高微生物的菌群含量。本研究發(fā)現(xiàn)，施氮影響了花生根際土壤環(huán)境，使根際土壤細(xì)菌群落多樣性產(chǎn)生較大差異，過量施人氮肥會導(dǎo)致土壤微生物群落不穩(wěn)定，可能是在含氮較高的土壤中，花生結(jié)瘤固氮量少，固氮細(xì)菌群落的生長受到抑制。16S rRNA功能預(yù)測表明施氮對花生根際土壤微生物群落的功能豐度譜產(chǎn)生一定的影響，施氮處理下的細(xì)胞運(yùn)動等功能基因的豐度相對升高，可能與土壤環(huán)境的變化導(dǎo)致花生根際土壤細(xì)菌代謝發(fā)生改變有關(guān)。氮肥對土壤中微生物的影響也與土壤的環(huán)境因素和作物管理等條件有關(guān)，施氨水平對花生根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響還需要進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。因此，今后還應(yīng)深入研究不同施肥措施對花生根際微生態(tài)的影響，探討根系發(fā)育與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的關(guān)系，以期為花生建立合理的施肥制度和提高氮肥利用率提供理論支撐。

4結(jié)論

與不施氮相比，施氮可以提高花生根際微生物群落的豐富度和多樣性，以中量氮肥的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)最高?；ㄉH土壤細(xì)菌群落以變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門和厚壁菌門等優(yōu)勢菌門為主，施氮處理提高了變形菌門和放線菌門的相對豐度，但其豐度并沒有隨著施氮量的增加而一直增多。施氮處理下的OTUs數(shù)均多于不施氮，中氮處理下的OTUs數(shù)最多，且隨著氮肥施入量的增加呈先升高后降低的趨勢。不施氮和在低、中量氮肥施用范圍內(nèi)，土壤微生物群落穩(wěn)定，過量施入氮肥會導(dǎo)致土壤微生物群落不穩(wěn)定。