龔享文 崔開旺 劉春云 陳 謙 黃玉梅 劉 輝

贛州市第五人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 贛州市呼吸病防治研究所,江西省贛州市 341000

肺塵埃沉著病是由職業(yè)因素暴露,長期吸入工作中的礦物粉塵引起的以慢性肺部炎癥和進行性肺纖維化為主要病理特征的全身性疾病,簡稱塵肺病[1]。當前臨床治療塵肺病的藥物鮮少,且價格昂貴,不良反應多,患者難以承受。而中醫(yī)藥在治療塵肺病中具有良好的療效,在延緩塵肺病患者病情進展、提高生活質量和減少并發(fā)癥方面具有明顯優(yōu)勢。補肺溫金湯是治療塵肺病的經驗方,由黨參、陳皮、半夏、白術、茯苓、砂仁、木香、甘草八味中藥組成。該方具有補肺健脾、理氣化痰的功效,能夠緩解塵肺病患者呼吸急促,改善肢體乏力等癥狀。因此,本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法,篩選和挖掘補肺溫金湯防治肺塵病的關鍵靶標和富集通路,并通過分子對接方法對關鍵因子進行驗證,以期揭示補肺溫金湯防治塵肺病的潛在機制,為臨床治療提供科學依據(jù)。

1 方法

1.1 補肺溫金湯有效成分及對應靶點預測 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)中逐個搜索補肺溫金湯有效成分。設置生物利用度(Oral bioavailability,OB)>30%,類藥性(Drug-likeness,DL)>0.18。由于甘草成分較多,加用ADME參數(shù):脂水分配系數(shù)(AlogP)<5、H鍵供體數(shù)量(Hdon)<5、H鍵受體數(shù)量(Hacc)<5、腸上皮通透性(Caco-2)≥-0.40。利用UniProt數(shù)據(jù)庫,對補肺溫金湯各個藥物的成分靶點信息進行靶基因Symbol校正。在TCMSP中符合篩選標準但未檢索到靶蛋白的中藥有效成分,利用Pubchem數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction平臺,預測出其活性成分的潛在靶點。

1.2 補肺溫金湯與塵肺病相關靶點預測及補肺溫金湯與塵肺病共同靶點 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、Pharm GKB數(shù)據(jù)庫獲得塵肺病靶點信息。使用Venny在線網(wǎng)站繪制韋恩圖,得到補肺溫金湯與塵肺病的共同靶點,作為補肺溫金湯防治塵肺病的潛在靶點。

1.3 蛋白質—蛋白質互作關系網(wǎng)絡構建 在蛋白互作平臺STRING對應的程序接口輸入補肺溫金湯與塵肺病的共同預測靶點,設置物種為“Homo sapiens”,繪制蛋白互作關系網(wǎng)絡圖,最低相互作用評分設置為“medium confidence(0.400)”,從而得到PPI蛋白互作關系圖,同時使用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化。

1.4 補肺溫金湯—成分—共同靶點網(wǎng)絡圖構建 利用Cytoscape 3.7.2軟件中構建“補肺溫金湯—化合物—共同靶點”網(wǎng)絡并進行可視化分析,得到各節(jié)點的degree值。

1.5 富集分析 將補肺溫金湯成分靶點與塵肺病共同靶點利用R語言進行GO富集分析和KEGG通路分析。以P<0.01為篩選條件,對排名前20的信號通路以氣泡圖形式展示。為進一步從信號通路角度分析補肺溫金湯防治塵肺病可能的調控機制,以P<0.01、富集基因數(shù)≥6為篩選條件,并排除與塵肺病物關聯(lián)的信號通路,在此基礎上利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“有效成分—靶點—通路”網(wǎng)絡圖。

1.6 分子對接 對補肺溫金湯的成分與靶點進行條件篩選,將最可能發(fā)揮作用的關鍵成分與其對應的靶點能夠完全擬合-LogQ 值最大的那條通路所對應的共同靶點,載蛋白的3D結構在PDB數(shù)據(jù)庫中獲得,同時化合物的2D結構信息在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得。再使用Autodock vina軟件對這些成分與靶點進行分子對接,并使用Pymol軟件進行可視化作圖。

2 結果

2.1 補肺溫金湯活性成分及靶點預測 共得到補肺溫金湯有效成分89個,藥物潛在作用靶點253個,按OB值從大到小排列,前20個活性成分見表1。

表1 補肺溫金湯活性成分

2.2 塵肺病靶點預測 共獲得塵肺病相關基因191個。利用Venny圖獲得補肺溫金湯藥物靶點和塵肺病靶點共24個共同預測靶點。

2.3 補肺溫金湯防治塵肺病的蛋白互作網(wǎng)絡圖構建 在STRING數(shù)據(jù)庫獲得蛋白互作信息。使用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化(見圖1),由圖1可知補肺溫金湯—疾病核心靶點按連接節(jié)點數(shù)由多到少依次為:IL6、TNF、PTGS2、JUN、ICAM1、CASP3、IL10、IFNG、IL2、IL4等。

圖1 蛋白互作圖

2.4 補肺溫金湯—成分—共同靶點網(wǎng)絡圖構建 擁有交互基因的有效成分共有51個,使用Cytoscape 3.7.2軟件構建補肺溫金湯—成分—共同靶點網(wǎng)絡分析圖(見圖2)。根據(jù)degree值,在網(wǎng)絡中擁有最多交互基因的有效成分主要有:MOL000006(luteolin)、MOL000449(Stigmasterol)、MOL004932(glycyrrhizic acid)、MOL000358(beta-sitosterol)、MOL003896(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)等。

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析 24個共同靶點進行GO富集分析共1 260條目,其中生物過程(Biological process,BP)1 218條目,選出前20條(圖3列出前20條,P<0.05),主要涉及對脂多糖的反應、細胞因子產生的正調控、對細菌源性分子的反應、活性氧生物合成過程、對氧化應激的反應、對抗生素的反應、活性氧反應、細胞對化學應激的反應、平滑肌細胞增殖的調控、平滑肌細胞增殖等過程。

KEGG通路共98條目,以P<0.01為篩選條件,列出前20條KEGG通路,繪制氣泡圖,見圖4。前10條為:C-type lectin receptor signaling pathway(C型凝集素受體信號通路)、IL-17 signaling pathway(IL-17信號通路)、Inflammatory bowel disease(炎癥性腸病)、T cell receptor signaling pathway(T細胞受體信號通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1信號通路)、TNF signaling pathway(TNF信號通路)、Tuberculosis(肺結核)、Allograft rejection(同種異體移植排斥反應)、Malaria(瘧疾)、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路)。

圖4 KEGG分析圖

2.6 有效成分—靶點—通路網(wǎng)絡圖 根據(jù)補肺溫金湯有效成分、共同靶點與信號通路之間的聯(lián)系,構建有效成分—靶點—通路網(wǎng)絡圖,見圖5。luteolin為與網(wǎng)絡中擁有最多交互通路的有效成分,與成分—共同靶點網(wǎng)絡圖分析結果相符。

圖5 補肺溫金湯防治塵肺病的有效成分—靶點—通路網(wǎng)絡圖

2.7 分子對接結果 在2.4及2.6篩選出來的核心活性成分luteolin與2.3中的前兩個核心靶點IL-6、TNF輸入Autodock vina軟件中進行半柔性分子對接。用Pymol軟件進行可視化。對接結果見表2、圖6。木犀草素成分與IL-6、TNF對接分數(shù)分別為-30.56、-31.39kcal/mol,木犀草素與核心靶點對接較穩(wěn)定。

圖6 Luteolin與IL-6、TNF分子對接圖

表2 對接分數(shù)(kcal/mol)

3 討論

中醫(yī)學根據(jù)塵肺病咳、痰、喘、胸悶痛等一般臨床癥狀,可將塵肺病歸入中醫(yī)學“肺痹”“肺痿”“肺脹”等范疇[2]?；颊呤芙鹗?邪氣入肺,留滯于內,阻滯氣機,肺宣降失常,日久致氣、痰、濕瘀滯凝積成結節(jié),損傷肺絡,最終導致機體陰陽失衡,臟腑功能受損,病位在主要肺,病久影響脾、腎。補肺溫金湯組方中黨參、茯苓、白術補脾肺氣,可增強機體自我修復能力;陳皮健脾燥濕、理氣化痰,為治痰要藥;半夏燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結,與陳皮、茯苓合用,可增強健脾化痰之效;砂仁化濕醒脾、溫中行氣,為醒脾調胃要藥;木香行氣調中、通暢氣機;炙甘草甘溫,健脾補氣、調和諸藥;諸藥合用可達補肺健脾、理氣化痰之效,同時寓有培土生金之意。

如本研究所示,補肺溫金湯治療塵肺病的核心成分有89個,其中木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)被確定補肺溫金湯防治塵肺病的關鍵有效成分。已有研究表明,木犀草素、豆甾醇、甘草酸、β-谷甾醇通過調節(jié)多種因子和信號通路(如Fn-EDA、TGF-β1、TGF-β1/Smads、p38MAPK信號通路),促進肺組織自愈、平衡肺組織氧化還原反應、抑制氣道局部炎癥、減少膠原沉積,抑制由博來霉素或二氧化硅引起的實驗性肺纖維化,抑制細胞外基質重塑,改善肺功能,從而達到改善肺纖維化的作用[3-4]。

GO富集分析和KEGG富集分析顯示補肺溫金湯防治塵肺病涉及C型凝集素受體信號通路、IL-17信號通路、T細胞受體信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等多個通路。C型凝集素樣受體(CTLR)是一種基于免疫受體酪氨酸基序的受體,通過調控基因轉錄和細胞因子激活,調節(jié)促進纖維化[5]。IL-17可通過激活NF-κB、JNK等多條信號通路,直接或間接地參與調控多種炎癥反應及自身免疫反應性疾病[6]。AGE及其受體 (RAGE) 已被證明與肺泡穩(wěn)態(tài)以及肺纖維化有關[7]。肺纖維化中AGE/RAGEs 比例升高導致肺持續(xù)纖維化以及肺上皮間質修復功能下降[8]。HIF-1信號通路、TNF信號通路對免疫炎癥反應、氧化應激反應等病理生理過程具有重要的調控作用[9-10]。以上表明,補肺溫金湯通過調節(jié)炎癥反應以及免疫反應等信通路,發(fā)揮防治塵肺病的作用。

白細胞介素(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、前列腺素G/H合酶 2(PTGS2)、轉錄因子AP-1(JUN)、細胞間黏附分子1(ICAM1)、胱天蛋白酶1(CASP3)、白介素10(IL-10)、干擾素γ(IFNG)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)是PPI網(wǎng)絡中篩選出來的關鍵基因。分子對接結果表明,核心成分木犀草素與IL-6、TNF、PTGS2、JUN、ICAM1對接良好,驗證網(wǎng)絡藥理學對補肺溫金湯防治塵肺病預測機制的準確性。近年研究發(fā)現(xiàn),在塵肺病發(fā)病過程中,巨噬細胞會激活IL-6、TNF等炎癥因子,誘發(fā)肺纖維化炎癥反應[11]。IL-6是M2型巨噬細胞選擇性激活的重要因子,可調控巨噬細胞向促炎型細胞表型的轉移,誘導成纖維細胞活化[12]。TNF信號通路與肺纖維化發(fā)展過程密切相關,已有動物實驗表明,在二氧化硅誘發(fā)的肺纖維化過程中,血清中TGF-β、TNF-α、FGF含量隨著二氧化硅濃度的增加而增加,表明TGF-β、TNF-α、FGF是治療肺纖維化的關鍵靶點[13]。JUN是IL-17信號通路的下游基因,協(xié)調細胞周期、自我更新、新陳代謝和存活等對細胞生長和增殖至關重要的基因的轉錄,參與炎癥通路的激活。同時,JUN可阻斷白細胞(CD45)、上皮細胞(CK7)和內皮細胞(CD31)的表達,增加促纖維化成纖維細胞的吞噬作用和消除對適應性免疫的抑制作用[14]。IL-10的抑制作用主要通過抑制IFN、TNF、IL-1、IL-2、IL-6和粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、趨化因子等炎性細胞因子的分泌來發(fā)揮抗炎作用[15]。近年來的研究表明,IL-10在組織纖維化的作用已逐漸被知曉,如IL-10通過抑制體內和體外肺泡巨噬細胞產生的TGF-β1抑制肺纖維化的發(fā)展[16]。

綜上所述,本研究從網(wǎng)絡藥理學角度闡釋了補肺溫金湯多成分、多靶點和多通路的調控機制。組方可能通過木犀草素、豆甾醇、甘草酸、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等關鍵成分,作用于IL6、TNF、PTGS2、JUN、IL10等多個靶點,調節(jié)免疫炎癥反應、氧化應激等過程,干預C型凝集素受體信號通路、IL-17信號通路、T細胞受體信號通路等多個通路,改善塵肺病的肺纖維化損傷。