劉高麗 吳松 谷存國(guó)

作為食品專業(yè)重要的基礎(chǔ)技能課程，儀器分析實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證和鞏固理論知識(shí)不可缺少的實(shí)踐教學(xué)環(huán)節(jié)。在科教融合理念背景下，儀器分析課程更是培養(yǎng)食品專業(yè)學(xué)生科研創(chuàng)新能力，與鞏固基礎(chǔ)專業(yè)知識(shí)最具有研究意義的一門學(xué)科。本文將以植物肉中丙烯酰胺測(cè)定的方法為主線，運(yùn)用儀器分析方法進(jìn)行科教融合探索。

一、研究背景

1.科研背景。近年來，植物蛋白肉以其綠色、健康及可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)勢(shì)，被廣大科研工作者所關(guān)注。相對(duì)于國(guó)外植物肉的應(yīng)用已日漸成熟，國(guó)內(nèi)植物肉的發(fā)展剛剛起步，因此深入研究植物肉是一個(gè)非常重要的科研方向。植物肉常用大豆豆粕或大豆分離蛋白等植物性基料為原料，經(jīng)雙螺桿擠壓機(jī)制成植物拉絲蛋白坯料，再進(jìn)一步加工制成有纖維狀態(tài)、類似肉類質(zhì)感的蛋白質(zhì)。這種原料中存在蛋白質(zhì)與糖類的高溫加工過程，不可避免會(huì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)及其副產(chǎn)物丙烯酰胺。

丙烯酰胺是一類具有生殖毒性的物質(zhì)，而食品檢測(cè)中常用的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法在檢測(cè)過程中因?yàn)楦邷貧饣^程可能會(huì)導(dǎo)致丙烯酰胺的產(chǎn)生，所以被認(rèn)為不適合檢測(cè)丙烯酰胺。最前沿的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為多反應(yīng)檢測(cè)方法，2022年時(shí)也被發(fā)現(xiàn)有纈氨酸、乳酸酰胺與3-氨基丙烯酰胺等干擾物，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏高，因此要求檢測(cè)過程中必須證明檢測(cè)方法是可靠的，而且要進(jìn)行充分的驗(yàn)證。

2022年，Nail Altunay發(fā)現(xiàn)紫外可見分光光光度法檢測(cè)丙烯酰胺的檢測(cè)限可以達(dá)到0.2ng/mL-0.6ng/mL，而且相對(duì)于以上儀器對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，紫外可見分光光度計(jì)操作簡(jiǎn)單、成本低，更適合新手實(shí)驗(yàn)。

2.教學(xué)背景。丙烯酰胺是美拉德反應(yīng)的副產(chǎn)物，也是食品化學(xué)課程中食品糖類這一章節(jié)的內(nèi)容。學(xué)生已經(jīng)了解丙烯酰胺具體產(chǎn)生的反應(yīng)過程及其對(duì)人體的危害等背景知識(shí)，再利用儀器分析方法進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)已理解進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的重要意義，對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容高度重視。

二、方法設(shè)計(jì)

丙烯酰胺通常在紫外光區(qū)的吸收波長(zhǎng)為240nm或者290nm，溶液受到溶劑的影響，如將其衍生化，使其吸收波長(zhǎng)衍生至可見波長(zhǎng)范圍，檢測(cè)方法將變得更多樣。丙烯酰胺在堿性條件下生成的丙烯酰羥肟酸，可以在酸性條件下與三氯化鐵生成紅棕色絡(luò)合物。

衍生后的丙烯酰胺可使用儀器分析中的比色法與紫外可見分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，學(xué)生在掌握各種方法的同時(shí)，還能加深各個(gè)方法之間的聯(lián)系，對(duì)儀器分析有更深刻的認(rèn)識(shí)。

三、方法檢測(cè)

1.試劑與儀器。鹽酸羥胺，NaOH，鹽酸，氯化鐵，丙烯酰胺，市售植物肉，UV-5500紫外-可見分光光度計(jì)。

2.比色法。稱取0.1000g丙烯酰胺，用蒸餾水溶解后移入1000mL容量瓶中，稀釋至刻度，并定為儲(chǔ)備液。分別移取儲(chǔ)備液0mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL至10mL比色管中，添加蒸餾水至5mL，將溶液配成濃度分別0μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按濃度大小編號(hào)為1、2、3、4、5。

稱取植物肉1g，于研缽中磨碎。放入20mL離心管中，加入3mL水，超聲提取2min。移取上清液至25mL的具塞量筒中，加入3mL乙腈、石油醚、2g氯化鈉。震蕩，吸取水層溶液至相同比色管中，添加蒸餾水至5mL，編號(hào)為6。

于55℃下，分別將2mL的20%鹽酸羥胺溶液與0.5mL的20%NaOH溶液加入比色管中，搖勻并繼續(xù)反應(yīng)1h。冷卻到室溫后，加入1mL的3N鹽酸與1mL的10%氯化鐵溶液，震蕩。將樣品管與標(biāo)準(zhǔn)系列試管進(jìn)行對(duì)比，對(duì)樣品中丙烯酰胺的含量進(jìn)行初步判斷。

3.薄層層析法。取標(biāo)準(zhǔn)樣品5號(hào)與6號(hào)分別在薄層層析板上進(jìn)行點(diǎn)樣，并將二者的混合點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)樣。將點(diǎn)樣完成的層析板放入展開劑（乙酸乙酯：無水乙醇=1：1）中，展開后觀察結(jié)果，如果斑點(diǎn)顏色過淺，可用固體碘進(jìn)行顯色。

4.紫外可見分光光度法。將上述1-5號(hào)樣品分別裝入玻璃比色皿中，使用紫外-可見分光光度計(jì)于510nm下檢測(cè)其吸光度，并制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同的紫外波長(zhǎng)下，檢測(cè)樣品6的吸光度。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理

如圖1所示，1-5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的顏色隨著丙烯酰胺的濃度增大而加深，6號(hào)樣品比所有標(biāo)準(zhǔn)樣品的顏色深，初步判斷丙烯酰胺含量大于標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大濃度。但眾所周知，植物肉在加工過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生類黑精色素，與紅棕色絡(luò)合物顏色相近，如果只是簡(jiǎn)單地根據(jù)顏色來判斷丙烯酰胺的含量，準(zhǔn)確率較低。

接下來，使用薄層層析來判斷呈色物質(zhì)是否一致。選擇標(biāo)準(zhǔn)樣品中的5號(hào)與植物肉樣品6號(hào)進(jìn)行對(duì)比。如圖2所示，5號(hào)與6號(hào)樣品的斑點(diǎn)高度基本一致，混合點(diǎn)也證實(shí)二者為同一種物質(zhì)，說明可以通過顏色來判斷其含量。

最后，使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其具體含量。如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值為99%，得到濃度與吸光度的方程為A=0.01301+0.01833c，R2=0.97277。由此得出植物肉的丙烯酰胺含量為1.8μg/g，換算單位為1800μg/kg，為歐盟標(biāo)準(zhǔn)基準(zhǔn)水平值（750μg/kg）的2.4倍，不適合食用。

五、結(jié)論

本文以植物肉的丙烯酰胺檢測(cè)為主線，將比色法、薄層層析法、紫外分光綜合實(shí)驗(yàn)串聯(lián)在一起。比色法讓學(xué)生理解了濃度與顏色的關(guān)系，薄層層析法充分證實(shí)了產(chǎn)生顏色的原因是同一種物質(zhì)，紫外-可見分光光度計(jì)則在兩種方法的基礎(chǔ)上，給出了植物肉中丙烯酰胺的具體含量。在此過程中，學(xué)生掌握了標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、薄層層析的使用方法、紫外-可見分光光度計(jì)的使用等基本實(shí)驗(yàn)技能，學(xué)會(huì)了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理的方法，利用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用相關(guān)公式計(jì)算出樣品的濃度。同時(shí)，能夠在實(shí)驗(yàn)中將儀器分析中的光學(xué)分析方法與色譜分析方法結(jié)合起來，充分利用各種儀器分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)，不僅扎實(shí)地鍛煉了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作技能，更培養(yǎng)了科學(xué)素養(yǎng)與創(chuàng)新意識(shí)。

總之，以“植物肉中丙烯酰胺的檢測(cè)”進(jìn)行的科教融合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步幫助學(xué)生了解了食品儀器分析的重要性，為國(guó)家培養(yǎng)科技創(chuàng)新型人才打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，具有重要的戰(zhàn)略意義。

基金項(xiàng)目：漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校研究項(xiàng)目——豆渣復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵的資源化研究（2020-LYZKYYB023）；基于全國(guó)檢驗(yàn)技能競(jìng)賽對(duì)微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目的融合改進(jìn)與創(chuàng)新（2021-LYZJGYB011）；微生物學(xué)檢驗(yàn)活頁教材建設(shè)（2021-LYZJGYB016）；2020年微生物學(xué)檢驗(yàn)線上/線下混合式“金課”建設(shè)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：劉高麗（1985-），女，講師，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)、微生物。

*通信作者：谷存國(guó)（1967-），男，主任技師，研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)教育。