曹張歡 蔣顯鋒 黃子靜 孫杰

現(xiàn)如今，酒類飲品超范圍、超限量使用食品添加劑的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，如白酒中超范圍或超限量使用甜蜜素、糖精鈉；葡萄酒中超范圍或超限量使用三氯蔗糖；果酒中超范圍或超限量使用苯甲酸、合成著色劑；露酒中超范圍或超限量使用甜蜜素、三氯蔗糖等。目前我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有同時(shí)檢測(cè)這四類酒中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)的方法標(biāo)準(zhǔn)。本文應(yīng)用高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜技術(shù)，測(cè)定了四類酒中12種食品添加劑，探索了同時(shí)使用分子離子、特征碎片離子和保留時(shí)間作為定性依據(jù)，對(duì)多種食品添加劑進(jìn)行檢測(cè)的新方法。

一、材料與方法

1.材料與試劑。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（1000mg/mL）：苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、糖精鈉、三氯蔗糖、甜蜜素、安賽蜜、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)；甲醇（99.9%，色譜純）；乙酸銨（99.0%，macklin，色譜純）；乙酸銨溶液（5mmol/L）：稱取0.39g乙酸銨，用水溶解并稀釋至1000mL，搖勻后經(jīng)0.22μm水相微孔濾膜過(guò)濾備用；流動(dòng)相A：甲醇+乙腈（2+1），流動(dòng)相B：5mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%氨水）；0.22μm水相微孔濾膜。

2.儀器與設(shè)備。賽多利斯電子天平（精度：0.0001）；電熱恒溫水浴鍋；賽默飛UltiMate3000型高效液相色譜儀，由二元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器組成；AB SCIEX API3200型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配電噴霧電離源（ESI）。

3.方法。（1）色譜條件。色譜柱為AcclaimTM120 C18柱（3μm，30×100mm，賽默飛公司）；流動(dòng)相A為甲醇+乙腈（2+1），流動(dòng)相B為5mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%氨水）；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為30μL。

梯度洗脫條件：流速0.4mL/min。0-5min（95%流動(dòng)相B），5-10min（30%流動(dòng)相B），10-12min（95%流動(dòng)相B），12-20min（95%流動(dòng)相B）。

參考保留時(shí)間（RT）：苯甲酸（2.95min）、山梨酸（3.35min）、脫氫乙酸（2.95min）、糖精鈉（3.54min）、三氯蔗糖（5.35min）、甜蜜素（4.23min）、安賽蜜（2.68min）、檸檬黃（4.24min）、日落黃（4.25min）、莧菜紅（3.16min）、胭脂紅（3.82min）、亮藍(lán)（5.66min）。

（2）質(zhì)譜條件。電離源：電噴霧負(fù)離子模式（ESI-）；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化電壓（IS）為-4500V；噴霧氣壓力（GS1）為55Psi；輔助加熱氣壓力（GS2）為55Psi；氣簾氣壓力（CUR）為15Psi；離子源溫度（TEM）為300℃；噴撞氣（CAD）：5；接口加熱（ihe）：打開(kāi)；其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。稱取2.5g白酒、葡萄酒、果酒、露酒陰性基質(zhì)于25mL容量瓶中，根據(jù)樣品中添加劑的含量情況，加入標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用初始流動(dòng)相定容，使標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣液中目標(biāo)峰的峰面積相近。

（4）樣品處理。稱取酒樣2.5g，置于50mL燒杯中，于60℃水浴30min，用初始流動(dòng)相洗滌殘?jiān)?，并全部轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容并搖勻，經(jīng)0.22μm水相微孔濾膜過(guò)濾，上液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。

（5）條件優(yōu)化。①溶劑的選擇。由于檢測(cè)項(xiàng)目涉及多種食品添加劑，前處理必須兼顧絕大多數(shù)組分的提取效率。大多數(shù)添加劑均為鈉鹽或鉀鹽，具有較好的水溶性，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)摸索質(zhì)譜條件時(shí)用初始流動(dòng)相溶解標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，比用純水溶解會(huì)大大增加幾種合成著色劑的響應(yīng)值?？紤]到提高離子化效率，最終選擇用5+95的流動(dòng)相A+流動(dòng)相B作為提取液。實(shí)驗(yàn)表明：流動(dòng)相A用甲醇+乙腈（2+1），能更好地減小峰面積重復(fù)性誤差；流動(dòng)相B為5mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%氨水），可以使各組分響應(yīng)值達(dá)到相對(duì)較高值。

②液相色譜條件的優(yōu)化。由于檢測(cè)組分多達(dá)12種，且含有胭脂紅和莧菜紅兩種同分異構(gòu)體，所以快速、高效的分離尤為重要。本實(shí)驗(yàn)選用了AcclaimTM120 C18柱（3μm，30×100mm，賽默飛公司）作為分析柱，以甲醇和5mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，絕大多數(shù)添加劑分離良好，全部組分在6min內(nèi)出峰，包括系統(tǒng)平衡和沖洗殘留物在內(nèi)，僅需20min即可完成一個(gè)樣品的篩查。

③質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。將各添加劑標(biāo)樣溶液注入質(zhì)譜儀，對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的靈敏度和足夠的子離子信息。其中，去簇電壓和碰撞能量是質(zhì)譜參數(shù)中最重要的2個(gè)參數(shù)。去簇電壓直接影響各組分的靈敏度，隨著去簇電壓的升高，各添加劑的響應(yīng)值逐漸增強(qiáng)，但去簇電壓過(guò)高可能導(dǎo)致色素分子離子在離子源內(nèi)因共振而碎裂、解離，反而影響母離子的靈敏度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，在去簇電壓15-70V、碰撞能量7-79eV時(shí)，絕大部分添加劑可獲得較強(qiáng)的子離子。

④其他條件的優(yōu)化。由于基質(zhì)效應(yīng)明顯，因此選擇了基質(zhì)加標(biāo)的方法減小基質(zhì)效應(yīng)。合成著色劑在做曲線時(shí)呈拋物線趨勢(shì)明顯，所以選擇單點(diǎn)法配制標(biāo)液。由于酒類樣品中乙醇含量較高，因此應(yīng)該進(jìn)行除乙醇處理。

二、結(jié)果與分析

1.基質(zhì)效應(yīng)研究。（1）基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法。本研究采用斜率法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，4類酒中12種添加劑的基質(zhì)效應(yīng)詳見(jiàn)表2。斜率法：ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。若 ME=1，表示不存在基質(zhì)效應(yīng)；ME>1（或ME-1>0），為增強(qiáng)效應(yīng)；ME<1（或ME-1<0），為抑制效應(yīng)。若0.8≤ME≤1.2，為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)0.51.5時(shí)，為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。

（2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表2可知，檢測(cè)12種添加劑時(shí)，75%以上具有中等基質(zhì)效應(yīng)，通過(guò)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線、同位素內(nèi)標(biāo)、稀釋樣品溶液以及優(yōu)化色譜條件和采集方式，均能有效補(bǔ)償12種化合物的基質(zhì)效應(yīng)。由于酒類食品基質(zhì)復(fù)雜、同位素內(nèi)標(biāo)物價(jià)格昂貴且不易購(gòu)買等原因，本實(shí)驗(yàn)采取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以減小基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.12種添加劑檢測(cè)研究。（1）方法的定性、定量、檢出限和定量限。進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，若樣品色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，并且在扣除背景后，樣品譜圖中各定性離子的相對(duì)豐度與濃度和同樣條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖相比，最大允許相對(duì)偏差符合歐盟2002/657/EC中規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中檢出相應(yīng)組分。但對(duì)于苯甲酸和山梨酸，由于在本方法的ESI－檢測(cè)模式下，只產(chǎn)生1個(gè)二級(jí)碎片離子，無(wú)法計(jì)算碎片離子的相對(duì)豐度，因此本方法采用保留時(shí)間結(jié)合1個(gè)Q1/Q3離子對(duì)進(jìn)行定性。按照方法配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的HPLC-MS條件下進(jìn)行測(cè)定，12種添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示，采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)MRM色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定最低定量限（LOQ），得到12種目標(biāo)組分的LOD和LOQ，具體見(jiàn)表3。由表3可知，各添加劑的LOD和LOQ分別為0. 01mg/kg-0.71mg/kg和0.05mg/kg-2.37mg/kg。

（2）準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)。分別準(zhǔn)確稱取不含待測(cè)化合物的白酒、葡萄酒、果酒、露酒樣品2.5g于25mL容量瓶中，用微量移液器準(zhǔn)確加入一定量的各添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，用初始流動(dòng)相定容至刻度，混勻，配成低、中、高3個(gè)濃度水平的質(zhì)量控制（QC）樣品，每一濃度進(jìn)行6次平行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)表4可知，白酒、葡萄酒、果酒、露酒中低、中、高3個(gè)濃度水平的各添加劑均具有較好的準(zhǔn)確度與精密度，

12種目標(biāo)化合物在白酒中的回收率為81.3%-113.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%-11.2%；在葡萄酒中的回收率為80.0%-112.5%，RSD為1.2%-12.3%；在果酒中的回收率為80.2%-112.9%，RSD為1.7%-10.0%；在露酒中的回收率為80.3%-104.5%，RSD為1.4%-10.8%。

3.方法的應(yīng)用。按照所建的方法對(duì)市售的23份白酒、24份葡萄酒、12份果酒、12份露酒中的12種添加劑進(jìn)行測(cè)定。葡萄酒樣品中，9份檢出含有山梨酸，含量在0.03g/kg-0.17g/kg。果酒樣品中，8份檢出含有山梨酸，含量在0.01g/kg-0.19g/kg；6份樣品檢出含有三氯蔗糖，含量在0.01g/kg-0.22g/kg；6份樣品檢出含有糖精鈉，含量在0.01g/kg-0.04g/kg；5份樣品檢出含有甜蜜素，含量在0.18g/kg-0.29g/kg；3份樣品檢出含有莧菜紅，含量在0.01g/kg-0.03g/kg；2份樣品檢出含有苯甲酸，含量在0.01g/kg-0.13g/kg。露酒中4份樣品檢出含有山梨酸，含量在0.07g/kg-0.17g/kg；4份樣品檢出含有三氯蔗糖，含量在0.05g/kg-0.10g/kg；3份樣品檢出含有甜蜜素，含量在0.14g/kg-0.61g/kg；1份樣品檢出含有胭脂紅，含量為0.23g/kg；1份樣品檢出含有莧菜紅，含量為0.05g/kg；1份樣品檢出含有亮藍(lán)，含量為0.01g/kg；1份樣品檢出含有苯甲酸，含量在0.07g/kg。

從檢測(cè)結(jié)果可以看出，葡萄酒中防腐劑的檢出率為38%左右；果酒中人工合成甜味劑的檢出率為58%，防腐劑的檢出率為75%，人工合成著色劑的檢出率為25%；露酒中人工合成甜味劑的檢出率為33%，防腐劑的檢出率為33%，人工合成著色劑的檢出率為25%。

根據(jù)GB 2760規(guī)定，所檢樣品的12種防腐劑、甜味劑、合成著色劑均在使用要求范圍內(nèi)。但需注意的是，配制酒使用復(fù)合甜味劑的現(xiàn)象較多，且這些甜味劑還不相同，說(shuō)明市場(chǎng)上已存在將多種人工合成甜味劑添加到配制酒中的現(xiàn)象，這應(yīng)引起食品安全監(jiān)管部門的足夠重視，以應(yīng)對(duì)潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

研究結(jié)果表明，高效液相色譜-質(zhì)譜是對(duì)白酒、果酒、葡萄酒、露酒中多種食品添加劑進(jìn)行檢測(cè)的有效技術(shù)，具有分離效率高、定性定量結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

基金項(xiàng)目：四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（SCSJ2021010）。