張 婷 馮 曼 張瑩瑩 張 玲 李新暢 李海燕 石愛麗 李 潔

（1承德市農林科學院，河北承德 067000；2河北民族師范學院，河北承德 067000）

我國北方地區(qū)秋冬漫長且溫度較低，農業(yè)廢棄物處理難度加大，發(fā)酵周期延長，易造成環(huán)境污染和資源浪費。研究認為，15 ℃是低溫堆肥的臨界溫度，當環(huán)境溫度低于15 ℃時，堆肥起溫速度降低甚至無法正常起溫，使得堆肥難以自發(fā)進行，無法有效發(fā)酵[1]?，F階段，冷涼地區(qū)為解決秋冬季節(jié)堆肥啟動保溫等問題，更多的采用向堆體中灌注熱水和蒸汽，或者增加保溫材料等方法，不僅費時、費力且效果不明顯。低溫菌在低溫狀態(tài)下可以利用其特殊的生理機制來降解堆肥物料中的糖類、淀粉、蛋白質等簡單的有機物，使肥堆溫度迅速上升，帶動纖維素降解菌等中溫功能菌進入中溫期，進而產生大量的生物能使堆肥進入高溫期，完成高溫階段無害化處理。

廢棄物腐熟過程中，受低溫環(huán)境及微生物酶活性的影響，單一的菌株因其穩(wěn)定性、存活率差，很難高效降解廢棄物，利用微生物間的協(xié)同作用來提高混合菌株的酶活和酶量，對于堆肥效率及品質的提高都有積極作用[2]。何志剛等[3]采用低溫連續(xù)富集繼代培養(yǎng)方法從低溫菌源樣品中篩選獲得一組高效穩(wěn)定分解玉米秸稈的復合菌群。王一然等[4]在宏基因組測序基礎上優(yōu)化低溫玉米秸稈降解菌群，使秸稈降解潛力顯著升高。但在農業(yè)廢棄物發(fā)酵中，僅有纖維素降解菌是不夠的。秸稈、菌渣、牛糞等農業(yè)廢棄物中的粗蛋白含量相對較高，篩選具有降解蛋白質功能的菌株，對于堆肥初期快速升溫也十分必要。此外，在堆肥前期，有機氮在微生物的代謝活動下會產生大量氨氣，而固氮微生物在除臭保氮方面發(fā)揮著重要作用，因此篩選低溫固氮菌，一方面能夠通過低溫菌的代謝活動加快堆肥溫度上升，另一方面還能夠通過固氮作用減少氨氣揮發(fā)，達到除臭保氮的效果[5]。糞便中的磷元素多以磷酸鈣等化合物形式存在，植物難以直接吸收利用，溶磷菌可以通過其代謝活動將難溶性磷分解為可被植物吸收利用的可溶性磷，從而提高磷元素的利用率。添加低溫微生物菌劑是低溫環(huán)境下實現堆肥快速啟動的有效方法，對農業(yè)廢棄物在低溫環(huán)境下迅速起溫發(fā)酵具有重要意義。本研究采用平板涂布法從低溫菌源樣品中篩選固氮、溶磷及分解蛋白質和纖維素的功能菌，以期為堆肥用低溫菌群的構建提供菌種基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2021年10月采自河北承德圍場燕格柏鄉(xiāng)自然腐熟的肥堆樣品，主要成分為牛糞、秸稈等農業(yè)廢棄物。

1.2 儀器與設備

ZWYR-D 疊式恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司），PHS-2F 型pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司），HWS 系列智能恒溫恒濕箱（浙江托普云農科技股份有限公司），752N紫外可見分光光度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基

（1）牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

（2）酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO42.0 g，瓊脂15.0 g，溴百里香酚蘭0.05 g，蒸餾水1 000 mL。

（3）羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5.0 g，KH2PO41.0 g，NaNO33.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，Fe3SO40.01 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

（4）無氮固體培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g，KH2PO40.2 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，CaSO40.1 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

（5）無機磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO40.3 g，MnSO40.03 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

（6）有機磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，酵母浸粉0.5 g，KCl 0.3 g，MgSO40.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO31.0 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.4 低溫菌分離純化

取樣品加入盛有無菌水的錐形瓶中，置于10 ℃低溫下充分振蕩30 min，將獲得的菌懸液按梯度稀釋至10-4、10-5、10-6濃度后，涂布至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，10 ℃低溫培養(yǎng)3～5 d，待有菌落長出后根據菌落不同形態(tài)挑取單菌落進行純化，直至獲得純菌株，并對不同單菌落進行編號。

1.5 低溫菌功能復篩

將獲得的單菌株分別接種至選擇培養(yǎng)基上，于10 ℃下培養(yǎng)3～5 d，觀察培養(yǎng)基上菌株生長情況，將能夠在選擇培養(yǎng)基上生長并有明顯透明圈的菌株轉接至相應的固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)，轉接至少3次以上獲得功能穩(wěn)定的菌株。

1.6 生理生化特性測定

根據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對篩選出來的低溫功能菌進行形態(tài)鑒定，并測定菌株的生理生化指標，包括甘露醇、木糖、V-P、明膠液化、淀粉水解等生化指標測定。

1.7 低溫功能菌拮抗試驗

采用交叉劃線法對獲得的低溫功能菌進行拮抗試驗，挑取各菌株單菌落在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上呈十字形交叉劃線，置于10 ℃低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察各菌株在交叉劃線處是否能夠正常連續(xù)生長，以驗證各菌株之間是否存在拮抗作用以及是否能夠聯合使用構建低溫菌系。

1.8 分子生物學鑒定

將功能復篩獲得的低溫菌株純化培養(yǎng)后，提取基因組DNA，并利用細菌通用引物27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R:GGTTACC TTGTTACGACTT進行PCR擴增，擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在NCBI上進行BLAST序列比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株分類地位。

2 結果與分析

2.1 低溫菌株的分離與純化

采用平板涂布法從樣品中共篩選出9 株細菌，在10 ℃低溫環(huán)境下生長良好且表現出不同的菌落形態(tài)。對篩選出來的低溫菌株進行編號，并挑取單菌落進行多次分離純化獲得純菌株。

2.2 低溫菌功能復篩

利用選擇培養(yǎng)基從篩選出的低溫菌中復篩具有固氮、解磷、分解酪蛋白以及降解纖維素的功能菌株，共獲得4 株低溫功能菌。其中，D21 具有固氮和溶解有機磷功能，D25和D29具有溶解有機磷、無機磷和分解酪蛋白的功能，D33 具有分解酪蛋白的功能，未篩選出纖維素降解菌（表1和圖1）。

圖1 低溫菌功能復篩效果

表1 低溫菌功能復篩結果

2.3 菌株生理生化特性

4株低溫功能菌生理生化指標鑒定結果見表2。4種菌V-P檢測均呈陰性，在7%鹽濃度及厭氧環(huán)境下均不能生長。檸檬酸鹽、丙酸鹽、D-木糖醇、L-阿拉伯糖、D-甘露醇條件下均能正常生長，pH 5.7 酸性條件下均能正常生長，且接觸酶試驗均呈陽性。淀粉水解測定結果顯示D25和D29菌株可以水解淀粉；只有D21 菌株能夠還原硝酸鹽；在明膠液化方面，除了D21菌株不能液化明膠外，其他3種菌均能夠液化明膠。

表2 4株菌株生理生化特征

2.4 菌株拮抗試驗

4 株低溫功能菌拮抗試驗結果如圖2 所示，4 株菌在十字交叉劃線處均可以正常連續(xù)生長，說明篩選出的4 株低溫功能菌之間沒有拮抗作用，能夠共同生長，可以聯合使用構建低溫堆肥復合菌劑。

圖2 低溫功能菌拮抗試驗結果

2.5 菌株的分子鑒定

將測序獲得的序列進行BLAST 比對，并構建系統(tǒng)進化樹，確定4株低溫功能菌分類地位，鑒定結果顯示，4株低溫菌分別為D21Pantoea coffeiphila、D25米氏假單胞菌（Pseudomonas migulae）、D29Pseudomonas canadensis，D33 蓋氏假單胞菌（Pseudomonas gessardii）（圖3）。

圖3 低溫菌株系統(tǒng)進化樹

3 討論與結論

好氧堆肥過程主要包括升溫階段、高溫階段和腐熟階段。起始升溫階段肥堆中的糖類、淀粉和蛋白質等易腐爛的有機物質被微生物分解，產生二氧化碳和氧氣并釋放能量，使堆肥溫度逐漸上升至高溫階段。堆肥易受外界環(huán)境溫度的影響，北方寒冷地區(qū)秋冬季節(jié)堆肥起溫比較緩慢，微生物代謝活動降低，發(fā)酵周期延長，嚴重降低了堆肥效率和有機肥品質。利用低溫功能菌的代謝活動，實現堆肥的快速啟動，成為現階段解決低溫發(fā)酵問題的有效方法。

本研究從農業(yè)廢棄物中篩選出低溫功能菌4株，具有固氮、溶磷和分解酪蛋白的功能，經鑒定這4種功能菌分別為泛菌（Pantoea coffeiphila）、米氏假單胞菌（Pseudomonas migulae）、Pseudomonas canadensis和蓋氏假單胞菌（Pseudomonas gessardii）。泛菌具有固氮功能，在10 ℃低溫環(huán)境下生長24 h 后OD 值可達1.374。在堆肥過程中氮素極易揮發(fā)損失，通過添加固氮微生物可以一定程度上提高堆肥的含氮量。蒲一濤和邢苗[6]發(fā)現在堆肥第2次發(fā)酵時添加固氮菌能夠加快肥堆的降解速率，縮短堆肥發(fā)酵時間，提高有機肥的肥效和品質，對提高土壤固氮能力和促進植物生長發(fā)育都具有積極作用。石春芝等[7]將自生固氮菌和纖維素分解菌加入堆肥中，發(fā)現堆肥中含氮量提高，且纖維素分解菌對固氮菌的生長表現出一定的協(xié)同效應。本研究篩選的固氮菌可以為廢棄物低溫發(fā)酵中生物保氮劑的研發(fā)應用提供菌種基礎。

米氏假單胞菌具有溶解有機磷、無機磷和分解酪蛋白的功能，該菌能在10 ℃低溫環(huán)境下生長，培養(yǎng)24 h后OD值可達1.945。研究表明，Pseudomonas migulae可作為低成本的生物接種劑，不僅能夠促進綠豆植物的生長[8]，還能夠促進番茄的生長[9]。Pseudomonas canadensis與米氏假單胞菌相似，具有溶解有機磷、無機磷和分解酪蛋白的功能，但與米氏假單胞菌不同的是，該菌在10 ℃培養(yǎng)24 h 后OD 值僅為0.518，說明其耐低溫能力比米氏假單胞菌差，但該菌在生防[10-11]方面表現出一定的優(yōu)勢。

蓋氏假單胞菌能夠分解酪蛋白，在酪蛋白培養(yǎng)基上產生明顯的透明圈。低溫環(huán)境下發(fā)酵，起溫階段需要有低溫菌株通過降解蛋白質等簡單有機物產生生物能來提高堆體溫度，蓋氏假單胞菌不僅在低溫發(fā)酵起溫階段起到重要作用，還能夠促進植物的生長。研究發(fā)現，蓋氏假單胞菌接種于大麥上能夠促進植株生長，提高葉綠素、酚類、可溶性糖等物質的含量[12]。

農業(yè)廢棄物的發(fā)酵過程實際上就是微生物發(fā)酵過程，微生物通過新陳代謝活動進行有機物分解，一方面可以維持自身的生命活動，另一方面分解產生的小分子物質可以直接被植物吸收利用。在低溫環(huán)境下，發(fā)酵需要低溫菌通過代謝活動產生熱量快速將堆體溫度升至中溫及高溫階段，以縮短發(fā)酵周期，克服低溫下發(fā)酵升溫緩慢的問題。本研究獲得的低溫功能菌，可以為低溫菌劑的研發(fā)提供菌種基礎，豐富微生物菌種資源。