劉 俊 管 聘 朱俊米 柏正平

湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院呼吸科，湖南 長(zhǎng)沙 410006

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PAH)是以肺中血管重構(gòu)，肺血管收縮反應(yīng)性增強(qiáng)導(dǎo)致平滑肌增厚，進(jìn)而引起管腔狹窄及機(jī)化導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓持續(xù)性升高的病理過程。PAH發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，肺血管的功能結(jié)構(gòu)受到多種細(xì)胞因子、離子通路、信號(hào)通路的影響[1-2]。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)阻塞氣流使機(jī)體長(zhǎng)期處于低氧狀態(tài)，這種低氧狀態(tài)可刺激多種信號(hào)分子及相關(guān)通路對(duì)肺血管產(chǎn)生影響，改變肺血管的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)展成慢性阻塞性肺疾病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓(COPD relatedpulmonaryarterial hypertension，COPD-PAH)。深入研究COPD-PAH發(fā)病機(jī)制及有效的治療手段，有益于指導(dǎo)臨床上防治肺心病。氧化應(yīng)激近年來已成為PAH發(fā)病機(jī)制中研究最熱的學(xué)說之一[3-4]。研究[5]顯示，氧化應(yīng)激可通過多種途徑參與肺動(dòng)脈血管重構(gòu)加速PAH的進(jìn)展。有實(shí)驗(yàn)[6-7]表明抗氧化治療，可抑制肺動(dòng)脈血管重塑及減輕肺循環(huán)壓力，這表明氧化應(yīng)激是肺動(dòng)脈高壓形成的重要因素。本課題柏正平教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)及COPD-PAH中醫(yī)病機(jī)原理，根據(jù)“飲瘀同治”的治則創(chuàng)立了復(fù)方葶藶子湯。研究顯示復(fù)方葶藶子湯可明顯改善COPD-PAH患者臨床癥狀及減少急性發(fā)病次數(shù)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[8-10]證實(shí)復(fù)方葶藶子湯可降低肺動(dòng)脈高壓，增強(qiáng)肺血管順應(yīng)性，改善肺血管重塑。但作用機(jī)制并不明確，由此，我們推測(cè)復(fù)方葶藶子湯可能通過調(diào)控的氧化應(yīng)激通路影響COPD-PAH的發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)條件 清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，鼠齡10～12周，體重(230±20)g，由湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物房，統(tǒng)一向湖南萊斯克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購[SYXK(湘)2019-0017]。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度22～26 ℃，控制相對(duì)濕度40%RH～70%RH環(huán)境，8～12 h通風(fēng)換氣1次，采用高溫高壓滅菌飼料及純凈水飼喂。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 復(fù)方葶藶子湯，處方組成：葶藶子15 g，黃芩10 g，桃仁10 g，紅花10 g，水蛭6 g，川芎15 g，茯苓15 g，桂枝15 g，白術(shù)15 g，矮地茶15 g，甘草6 g。

中藥采用湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院顆粒劑(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))。給藥劑量參考人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表，大鼠等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍。每只動(dòng)物每千克按臨床人(70 kg)的等效劑量為中劑量，0.5倍等效劑量為低劑量，2倍等效劑量為高劑量，故低劑量組、中劑量組、高劑量組生藥量分別為 2.56 g/kg、5.13 g/kg、10.26 g/kg。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將清潔級(jí)雄性SD大鼠50只隨機(jī)分為5組，每組10只，于右耳相同位置打記號(hào)釘標(biāo)記，分為正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只大鼠，依次編號(hào)并標(biāo)記。

2.2 模型制備 正常組：大鼠飼養(yǎng)在室溫條件22～26 ℃，相對(duì)濕度40%RH～70%RH環(huán)境中，飼料予高溫消毒滅菌，不予熏煙、氣管切開滴入脂多糖等操作，灌胃期間給與等劑量的生理鹽水，灌胃劑量10 mL/kg/d。模型組：造模方法同舒家澤等[11]采取熏煙、氣管暴露滴入脂多糖誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng)制作慢阻肺相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓模型。造模期間(d1～d60)，每日熏煙4 h。第1天水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定大鼠，備皮，切開頸部皮膚，鈍性分離出氣管，肉眼下用眼科剪，斜45°氣管剪開小口。然后用1 mL注射器滴入濃度1 mg/mL脂多糖0.2 mL，豎起固定夾板輕搖，使其充分進(jìn)入肺部。最后縫合頸部皮膚。第14天重復(fù)第1天操作，手術(shù)當(dāng)天不予熏煙處理。中藥(復(fù)方葶藶子湯)高、中、低劑量組的大鼠處理同模型組。

煙熏造模結(jié)束后次日開始灌胃，連續(xù)灌胃14 d。

表1 給藥劑量及方法

2.3 大鼠肺功能測(cè)定及肺動(dòng)脈壓測(cè)定

2.3.1 檢測(cè)大鼠肺功能 取仰臥位氣管插管，將大鼠放置于小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀內(nèi)，然后記錄相關(guān)肺功能指標(biāo)包括肺活量(FVC)、0.3秒用力呼氣量(FEV0.3)和FEV0.3/FVC。以驗(yàn)證慢性阻塞性肺疾病模型建立成功。

2.3.2 檢測(cè)平均肺動(dòng)脈壓 測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)術(shù)前12 h大鼠禁食無需禁水。給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量按0.3 mL/100 g計(jì)算，麻醉后固定大鼠，沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離出右側(cè)頸內(nèi)靜脈。將抗凝處理后的導(dǎo)管從頸內(nèi)靜脈進(jìn)入，到達(dá)肺動(dòng)脈后固定，活動(dòng)端連接壓力換能器，接入心電監(jiān)護(hù)系統(tǒng)，待肺動(dòng)脈壓力波形穩(wěn)定后，根據(jù)監(jiān)視器所示的壓力波形圖多次記錄肺動(dòng)脈壓，計(jì)算平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)。

2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理、取材及標(biāo)本制備

2.4.1 蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 平均肺動(dòng)脈壓檢測(cè)完后，麻醉狀態(tài)下，沿前正中線剪開大鼠，用真空采血管采集腹主動(dòng)脈血，隨后剖取肺組織，取右肺相同部位用生理鹽水沖洗，并用4%多聚甲醛固定備用；剩余部分肺組織置于生理鹽水中保存。多聚甲醛固定的肺組織按矢狀面取材，用酒精脫水，再用蘇木素浸染45 s，沖洗10 min去除多余染色液。然后選擇無水乙醇脫洗，使用伊紅染色液染色10 s。再行組織切片、脫水和包埋。4 μm連續(xù)切片，60 ℃烤干。然后脫蠟、水化后HE染色。標(biāo)本于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.5 檢測(cè)血清中氧化應(yīng)激因子 黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)大鼠血清中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活力值，按照SOD檢測(cè)試劑盒說明書操作，加入待測(cè)樣本、蒸餾水、酶工作液、酶稀釋液、底物應(yīng)用液，混勻，孵育20 min，450 nm處用酶標(biāo)儀讀數(shù)。按照如下公式計(jì)算SOD抑制率和SOD活力值。

2.6 Elisa檢測(cè)血清中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的含量 通過腹主動(dòng)脈采血獲取的大鼠血清樣品首先置于4 ℃冰箱中過夜保存，次日于臺(tái)式冷凍離心機(jī)上進(jìn)行離心處理。1000 g離心15 min，溫度6 ℃，隨后取上清液檢測(cè)備用。于室溫(約24 ℃)條件下配制洗液，并提前取出酶標(biāo)板放置30 min。按照順序依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液，PBS作為空白對(duì)照，加入體積100 μL。然后分別向各孔中加入50 μL的酶標(biāo)記溶液(注：空白對(duì)照孔不加)，隨后用封板膜密封酶標(biāo)板后置于37 ℃孵育箱中孵育1小時(shí)。取出酶標(biāo)板用濃縮洗滌液清洗酶標(biāo)板5次，保持各孔水壓，先后加入顯色劑A 50 μL及顯示劑B 50 μL。并于37 ℃避光條件下反應(yīng)20 min后加終止液50 μL以終止反應(yīng)，讀取并記錄OD值。然后采用 Curve Expert曲線分析軟件作曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)。根據(jù)提示計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，代入OD值以計(jì)算樣本濃度。

2.7 定量PCR檢測(cè) 取Trizol保存肺組織約0.02 g，于通風(fēng)櫥內(nèi)加Trizol充分研磨，室溫下裂解5 min。隨后加入三氯甲烷200 μL，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min。離心機(jī)轉(zhuǎn)速200HZ，控制溫度于4 ℃，離心15 min后將上層液相轉(zhuǎn)移到新的RNase-Free離心管中。加入等體積的異丙醇混勻，室溫靜置10 min。再將新離心管以200 HZ，4 ℃環(huán)境離心10 min去上清，加無菌DEPC水配制的75%乙醇，洗滌沉淀。再一次以200 HZ，4 ℃環(huán)境離心3 min去上清。干燥5～10 min。加入20～30 μL無菌無酶水溶解沉淀。最后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，在260 nm與280 nm處測(cè)其吸光度值，計(jì)算其濃度跟純度。

2.8 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 剪取約0.025 g組織樣品，用預(yù)冷的PBS洗滌一次，加入300 μL的RIPA裂解液，用生物勻質(zhì)儀調(diào)勻，冰上裂解10 min，4 ℃，200 HZ離心15 min。將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中備用。按照分子量分別切膠，將6張與膠同樣大小的濾紙和1張NC膜，一起浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中。按照濾紙，NC膜，膠，濾紙的順序依次放好。蓋上儀器，接通電源，300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜，各指標(biāo)及轉(zhuǎn)膜所需時(shí)間見抗體信息。轉(zhuǎn)膜之后取出于置于1*PBST中洗1次。通過一抗孵育、二抗孵育，用1*PBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗，按照如下比例稀釋后與膜共同室溫孵育90 min。孵育結(jié)束后1*PBST洗3次，每次15 min。

3 統(tǒng)計(jì)分析

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 大鼠的平均肺動(dòng)脈壓(mPAP) 與正常組比較，模型組及中藥各劑量組的mPAP均升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥各劑量組mPAP下降(P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組mPAP升高；與中劑量組比較，高劑量組大鼠mPAP降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 平均肺動(dòng)脈壓

4.2 大鼠血清中氧化應(yīng)激水平 與正常組比較，模型組的血清SOD活力值下降(P<0.05)；與模型組比較，中藥各劑量組血清SOD活力值升高(P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組血清中SOD活力值升高(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組SOD活力值升高(P<0.05)。與正常組比較，模型組及中藥各劑量組血清中MDA含量升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥各劑量組血清中MDA含量下降(P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組血清MDA含量下降(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組血清MDA含量下降(P<0.05)。詳見表3。

表3 血清中氧化應(yīng)激水平

4.3 大鼠的肺血管組織學(xué)改變 HE染色后，于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察可見，正常組的肺血管內(nèi)皮連續(xù)、管壁薄而均勻、管腔較大且通暢。COPD-PAH模型大鼠的肺血管的內(nèi)皮不連續(xù)，管壁增厚、管腔狹窄血管重構(gòu)較明顯(如圖1B)。與模型組比較大鼠的肺組織中血管壁變薄、官腔變大，其血管壁變薄及官腔變大程度與藥物劑量呈正相關(guān)。

A.正常組；B.為模型組；C.中藥低劑量組；D.中藥中劑量組；E.中藥高劑量組圖1 大鼠的肺血管組織HE染色圖 (×200 光鏡)

4.4 大鼠血清中cAMP含量 與正常組比較，模型組血清中cAMP含量下降(P<0.01)，中藥各劑量組血清中cAMP含量升高(P<0.05)；與模型組比較中藥各劑量組血清中cAMP含量升高(P<0.05)；與低劑量組比較中劑量組血清中cAMP含量升高；與中劑量組比較高劑量組血清cAMP含量升高(P<0.05)。見表4。

表4 血清中cAMP濃度

4.5 Siah2-mRNA相對(duì)表達(dá)量 與正常組比較，模型肺組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥各劑量組的肺組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量下降(P<0.01)；與低劑量組比較，中劑量組mRNA相對(duì)表達(dá)量下降；與中劑量組比較，高劑量組mRNA相對(duì)表達(dá)量下降(P<0.05)。見表5。

表5 肺組織中Siah2-mRNA相對(duì)表達(dá)量

4.6 Western Blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 與正常組比較，模型組的Siah2蛋白表達(dá)增大；中藥各組Siah2蛋白表達(dá)均少于正常組及模型組；中藥各組大鼠的肺組織中AKAP-121蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)。如圖2所示。

圖2 Siah2蛋白、AKAP-121蛋白表達(dá)水平圖

5 討論

本課題組提出飲瘀同治法自擬復(fù)方葶藶子湯；葶藶子通脈平喘，作為君藥；桂枝、茯苓、白術(shù)、甘草取苓桂術(shù)甘湯之意以溫化痰飲共為臣藥；桃仁、紅花、水蛭為活血祛瘀，矮地茶止咳平喘均為佐藥，黃芩清熱泄肺為使藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)葶藶子中有效成分可降低肺循環(huán)壓力，減輕肺瘀血，亦可解痙平喘[12]。還有強(qiáng)心、擴(kuò)張血管的作用，對(duì)肺動(dòng)脈高壓引起的肺心病均具有較好的療效[13]。

氧化應(yīng)激(oxidative stess，OS)，是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)的氧自由基生成增加或清除能力降低，導(dǎo)致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在組織或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程。當(dāng)肺組織里抗氧化應(yīng)激的能力下降不足以應(yīng)付氧化應(yīng)激因子的攻擊時(shí)常導(dǎo)致肺組織和肺血管的損傷[14]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種在機(jī)體抗氧化的關(guān)鍵生物酶。氧化應(yīng)激是肺動(dòng)脈高壓始動(dòng)因素之一，氧自由基本身及相關(guān)產(chǎn)物可損害肺動(dòng)脈血管的上皮組織，引起肺血管壁細(xì)胞的纖維化，肺血管的增厚導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓形成。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)參與多種細(xì)胞功能的生理調(diào)節(jié)。Carly Jones等[15]發(fā)現(xiàn)，cAMP在肺動(dòng)脈高壓患者的血清中表達(dá)上調(diào)，而且細(xì)胞外cAMP通路的激活可以抑制肺血管細(xì)胞的增殖和肺血管重塑，緩解肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)展。Siah2(siah E3 ubiquitin protein ligase 2)是泛素連接酶家族的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)，Siah2與細(xì)胞缺氧下的線粒體功能密切相關(guān)，主要是因?yàn)槿毖鯐?huì)刺激細(xì)胞內(nèi)糖酵解的發(fā)生，穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor ，HIF)及其控制相關(guān)基因的表達(dá)(如Glut1、PDK1)，而Siah2通過調(diào)節(jié)生理性缺氧下脯氨酰羥化酶的穩(wěn)定性來激活HIF，從而間接地調(diào)節(jié)線粒體的功能[16-17]。另一方面，線粒體A激酶錨定蛋白(AKAPs)為一個(gè)獨(dú)特的蛋白家族，它們與線粒體外膜結(jié)合并靶向蛋白激酶A(PKA)[18]。根據(jù)C端結(jié)構(gòu)的不同，AKAPs中的AKAP-121在氧化代謝和細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。當(dāng)敲降細(xì)胞的AKAP-121的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的線粒體結(jié)構(gòu)異常、活性氧的產(chǎn)生增加及線粒體功能的下降等，與肺心病的進(jìn)展密切相關(guān)[19-20]。

丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)是體內(nèi)自由基與不飽和脂肪酸氧化后的終產(chǎn)物，可反應(yīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷程度，MDA本身還可對(duì)線粒體多種酶活性產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組血清中MDA含量明顯高于正常組，說明在慢性阻塞性肺疾病相關(guān)的模型中機(jī)體內(nèi)慢性缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平的上調(diào)。灌服復(fù)方葶藶子湯低、中和高各劑量組的大鼠血清中MDA含量均明顯降低，表明復(fù)方葶藶子湯中某些成分可抑制缺氧狀態(tài)下氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷。

SOD和cAMP均是抗氧化因子，cAMP還可以對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，細(xì)胞cAMP通路的激活可以抑制肺血管細(xì)胞的增殖和肺血管重塑，緩解肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)展[28]。我們發(fā)現(xiàn)中藥各組大鼠血清中SOD和cAMP的含量均高于模型組，這表明復(fù)方葶藶子湯中的某些成分可以上調(diào)SOD和cAMP的表達(dá)以達(dá)到對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用。

Siah2可與多種底物蛋白特異性結(jié)合參與多種信號(hào)通路分子的傳導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡[17]。研究[21]表明AKAP-121表達(dá)下調(diào)時(shí)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的線粒體結(jié)構(gòu)異常、活性氧的產(chǎn)生增加及線粒體功能的下降等，與肺心病的進(jìn)展密切相關(guān)。而氧化應(yīng)激可激活Siah2誘導(dǎo)AKAP-121的蛋白酶體迅速降解[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢阻肺模型大鼠的肺組織中Siah2蛋白表達(dá)上調(diào)，AKAP-121蛋白表達(dá)受到抑制。COPD-PAH模型大鼠的肺組織中的Siah2表達(dá)受到抑制下調(diào)的程度與復(fù)方葶藶子湯的劑量呈正相關(guān)，以及 AKAP-121蛋白表達(dá)的；HE染色光鏡下模型大鼠的肺組織中血管壁增厚，官腔狹窄，復(fù)方葶藶子干預(yù)后血管壁變薄，官腔相對(duì)擴(kuò)大；模型大鼠的平均肺動(dòng)脈壓較正常組升高，中藥干預(yù)后可部分降低模型大鼠的平均肺動(dòng)脈壓。因此認(rèn)為，復(fù)方葶藶子湯可能通過調(diào)控cAMP-Siah2-AKAP121通路，減少氧化應(yīng)激對(duì)COPD-PAH大鼠的肺血管壁的損傷，降低肺動(dòng)脈壓，為臨床上復(fù)方葶藶子湯能有效治療 COPD-PAH 患者提供機(jī)制支持。