高秀蕊,孫春艷,胡冬梅,王雁群,周云,孫晶,王纓

(山東藥品食品職業(yè)學(xué)院,山東 淄博 255000)

柴歸夏婦安煎煮茶是醫(yī)療機構(gòu)一種中藥制劑,被應(yīng)用臨床多年,其主要成分有黃芩、柴胡、當(dāng)歸、白芍、川芎等,黃芩是君藥。該藥劑功能主治疏肝健脾、補瀉兼施、寒熱互調(diào),用于肝脾不和所致的絕經(jīng)前后諸證。君藥黃芩具有瀉火解毒、止血安胎、清熱燥濕等作用[1],其代表成分為黃芩苷,本研究方法根據(jù)《中國藥典》(2020年版)分析方法驗證指導(dǎo)原則[2]和《山東省醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》的要求,以君藥黃芩中的黃芩苷為指標,通過方法的系統(tǒng)性考察和對三批供試品的含量測定,確定并建立HPLC測定柴歸夏婦安煎煮茶中黃芩苷的含量方法。

1 儀器與試藥

使用的儀器與試藥詳見表1。

表1 使用的儀器與試藥

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 選擇檢測波長

通過查閱2020年版藥典一部[1]和文獻[3-9],含黃芩的制劑中黃芩苷的含量檢測方法,采用的波長多在274～280 nm之間,在波長190～800 nm掃描黃芩苷對照品溶液,確定黃芩苷的λmax=277 nm(圖1),因此選擇277 nm作為黃芩苷的檢測波長。

圖1 黃芩苷對照品紫外-可見掃描圖譜

2.1.2 選擇流動相

不同的制劑測定黃芩苷含量多采用甲醇(MeOH)-磷酸(H3PO4)為流動相,因此配制不同濃度配比的MeOH-H3PO4,進行考察。

經(jīng)過比較流動相的分離度(R)、理論塔板數(shù)(n)、保留時間(tR),綜合考慮,選擇MeOH-0.3%H3PO4(體積比45∶55)作為流動相。

2.1.3 考察提取溶劑

查閱藥典分別用70%EtOH、MeOH及50%MeOH作提取溶劑,用70%EtOH溶解樣品的含量明顯高于其它兩種溶劑,因此確定70%EtOH為提取溶劑。

2.1.4 考察超聲時間

設(shè)計三種超聲方案,時間分別為20,30,40 min,試驗測定結(jié)果為20 min含量偏低,30,40 min含量相差不大。綜合結(jié)果判斷,選擇30 min為超聲提取時間。

2.1.5 考察取樣量

稱取供試品質(zhì)量,數(shù)值分別為0.25,0.50,0.75 g,分別向樣品中加入70%的EtOH 100 mL溶解,比較測定結(jié)果相差不大,綜合判斷選擇0.5 g為取樣量。

綜上,色譜條件為反相C18柱;MeOH-0.3%H3PO4(體積比45∶55)為流動相;檢測λ為277 nm;40 ℃的柱溫;1.0 mL/min的流速;10 μL的進樣量,注入HPLC,記錄色譜圖。

2.2 溶液的制備

各類溶液的制備方法詳見表2。

表2 各類溶液的制備方法

2.3 方法學(xué)考察[2]

2.3.1 專屬性考察

分別精密量取10 μL表2中對應(yīng)的溶液注入HPLC進行測定(見圖2～4)觀察色譜圖,供試品與對照品有相對應(yīng)的色譜峰,而陰性對照品則無。因此判斷出藥方中其他的中藥成分和溶劑對測定結(jié)果沒有影響。

圖2 對照品HPLC圖

圖3 供試品HPLC圖

圖4 陰性對照品HPLC圖

2.3.2 精密度試驗

精密量取10 μL對照品溶液(表2)注入HPLC,連續(xù)6次進樣,計算RSD=0.18%。結(jié)果分析顯示精密度良好,符合2020年版藥典的要求。

2.3.3 重復(fù)性試驗

平行制備6份供試品溶液(依據(jù)表2)→按照2.1項下色譜的條件進樣,利用外標法計算含量,平均含量0.411 5%,RSD=1.0%。由結(jié)果判斷測定方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.4 回收率試驗

取同一批次樣品(批號:20221023,黃芩苷含量為0.411 5%)約0.25g,精密稱定→置于100 mL容量瓶中→加70 mL 70%的EtOH,在每份中精密加入5 mL對照品貯備液(表2),加70%EtOH溶解并稀釋至刻度,平行制備6份樣品液。分別精密量取10 μL制備好的樣品溶液、對照品溶液注入HPLC,計算結(jié)果,回收率99.86%(RSD=1.7%)(見表3),回收率良好。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.5 線性與范圍

分別精密吸取表2中對照品貯備液制成6種不同濃度的溶液:(1)1 mL置于20 mL容量瓶;(2)2 mL置于25 mL 容量瓶;(3)5 mL置于50 mL容量瓶;(4)3 mL置于25 mL容量瓶;(5)3 mL置于20 mL容量瓶;(6)5 mL置于25 mL容量瓶。分別加入70% EtOH稀釋至刻度,搖勻即得。分別精密量取10 μL上述(1)～(6)溶液注入HPLC。以橫坐標為進樣量(v),縱坐標為峰面積(A),作線性回歸(方程為y=37 659x-7 934.7,r=0.999 9)。分析試驗結(jié)果,濃度在9.62～38.47 μg/mL之間,黃芩苷的進樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系(如圖5所示)。

圖5 黃芩苷標準曲線

2.3.6 樣品穩(wěn)定性考察

取供試品溶液在0,1,2,4,6,8,10,12,18,24 h進樣,黃芩苷峰面積(A)的RSD=0.3%,分析試驗結(jié)果可以得出24 h內(nèi)的供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 樣品的測定

取三批供試品,根據(jù)表2中方法配制供試品溶液,精密量取10 μL的對照品溶液、供試品溶液分別注入HPLC→測定峰面積(A),含量用外標法計算。所得結(jié)果見表4。

表4 黃芩苷含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 比較含量測定方法

按照藥典方法、本法分別測定黃芩苷的含量,所得結(jié)果見表5～6。

表5 藥典方法測定結(jié)果

表6 本法測定結(jié)果

分析兩種方法測定的黃芩苷含量基本一致,無顯著性差異。

3.2 轉(zhuǎn)移率的計算

3.1項下黃芩飲片和2.4項下柴歸夏婦安煎煮茶中黃芩苷含量測定結(jié)果,得到的轉(zhuǎn)移率結(jié)果見表7所示,試驗結(jié)果符合要求。

表7 黃芩苷含量轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果

根據(jù)2020年版《中國藥典》一部中黃芩飲片中黃芩苷的含量限度應(yīng)≥8.0%和每袋柴歸夏婦安煎煮茶含黃芩以黃芩苷(C21H18O11)計劑量應(yīng)≥40.0 mg。流動相的選擇參考諸多文獻,對多種流動相進行了試驗考察,最終根據(jù)R、n、tR等,綜合考慮選擇流動相為MeOH-0.3%H3PO4(體積比45∶55)。采用HPLC法對柴歸夏婦安煎煮茶中的黃芩苷進行含量測定,方法快速、簡便,所得結(jié)果可靠、有效、準確,因此可作為本中藥制劑含量測定的方法使用。

4 結(jié)論

采用HPLC法測定柴歸夏婦安煎煮茶中黃芩苷的含量,方法快速、簡便,所得結(jié)果可靠、有效、準確,因此可作為本中藥制劑含量測定的方法使用。