張悅 舒劉芳 孫英新 姜希娟 王一婧

(1天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617;2佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院;3天津體育學(xué)院社會(huì)體育與健康科學(xué)學(xué)院)

隨著全球大多數(shù)國(guó)家步入老年化社會(huì),以動(dòng)脈粥樣硬化(AS)為基本病理特征的冠心病發(fā)病率逐年上升。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查結(jié)果顯示,盡管近年來(lái)發(fā)生AS的人群越來(lái)越趨向年輕化,但老年人仍是急性心血管事件發(fā)生的主要群體〔1〕,81%的心血管病患者死亡年齡>65歲〔2〕。隨著年齡增加,AS的危險(xiǎn)因素如高血壓、糖尿病、高脂血癥等發(fā)病率顯著增加。以上研究提示年齡對(duì)AS的發(fā)生發(fā)展有重要影響。

AS斑塊的穩(wěn)定性與斑塊纖維帽厚度、脂核大小、浸潤(rùn)的炎細(xì)胞數(shù)量等密切相關(guān)〔3〕。AS斑塊局部發(fā)生的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)降解等病理變化,?？蓪?dǎo)致斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂等一系列嚴(yán)重繼發(fā)性改變。衰老是AS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔4〕,可促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。隨著年齡增長(zhǎng),AS斑塊局部的炎癥細(xì)胞、炎癥因子和趨化因子等的比例發(fā)生變化,提示不同年齡段AS發(fā)生的病因、病變及其主要機(jī)制存在差異。本實(shí)驗(yàn)以載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠冠狀A(yù)S模型為研究對(duì)象,觀察老年與青年小鼠冠狀A(yù)S形態(tài)學(xué)差異,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析青年與老年ApoE-/-小鼠AS斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)指標(biāo)差異及存在差異的可能機(jī)制,為未來(lái)臨床針對(duì)AS個(gè)體化治療方案的選擇提供理論和科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡、32周齡SPF級(jí)雄性ApoE-/-小鼠及相同遺傳背景及匹配周齡C57BL/6J小鼠,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004。

1.2實(shí)驗(yàn)飼料 高脂飼料(21%乳脂+0.15%膽固醇),批號(hào)MD12015,購(gòu)于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和油紅O試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所;單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢Cloud-Clone Crop;Masson染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司;CD68、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1和血管細(xì)胞黏附因子(VCAM)-1兔單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)abcam公司;基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9兔多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)小鼠單克隆抗體購(gòu)于萬(wàn)類(lèi)生物科技;ICAM-1和VCAM-1引物購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4模型分組與制備 以8周齡C57BL/6J野生型小鼠作為青年對(duì)照(QC)組,以32周齡C57BL/6J 野生型小鼠作為老年對(duì)照(LC)組,以8周齡 ApoE-/-小鼠作為青年模型(QM)組,以32周齡 ApoE-/-小鼠作為老年模型(LM)組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,采用高脂飼料喂養(yǎng)模型組,用普通飼料喂養(yǎng)對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)周期共28 w,建立ApoE-/-小鼠冠狀動(dòng)脈AS模型。

1.5體質(zhì)量觀察及評(píng)價(jià)AS斑塊 在造模過(guò)程中,每周觀察體質(zhì)量變化。實(shí)驗(yàn)干預(yù)28 w結(jié)束后,用乙醚麻醉小鼠,采用小動(dòng)物彩超儀檢測(cè)主動(dòng)脈弓,以評(píng)估動(dòng)脈AS斑塊的形成。

1.6血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)干預(yù)28 w結(jié)束后,獲取血清,參照說(shuō)明書(shū),分別采用微板法檢測(cè)TG、TC、LDL-C、HDL-C水平,ELISA法檢測(cè)MCP-1水平。

1.7冠狀動(dòng)脈斑塊蘇木素-伊紅(HE)、Masson和油紅O染色觀察 預(yù)冷生理鹽水灌流去除血管內(nèi)殘余血液,取主動(dòng)脈根部平面的組織,部分于甲醛溶液固定或冰凍,常規(guī)石蠟或冰凍連續(xù)切片,分別行Masson、HE和油紅O染色。用 Leica Qwin Image Processing and Analysis 軟件分析切片染色結(jié)果,測(cè)量主動(dòng)脈根部水平冠狀動(dòng)脈主干處 AS斑塊面積、膠原纖維含量和斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量。

1.8免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD68及MMP9在冠狀動(dòng)脈AS斑塊中的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,行免疫組化染色,使用IPP圖像分析軟件分析免疫組化染色結(jié)果,測(cè)量主動(dòng)脈根部水平冠狀動(dòng)脈主干處AS斑塊面積(PA)、斑塊內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)面積/陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù),計(jì)算斑塊內(nèi)陽(yáng)性面積的百分比(陽(yáng)性面積/PA)。

1.9石蠟切片普魯士藍(lán)染色檢測(cè)冠狀動(dòng)脈斑塊內(nèi)出血情況 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,參照普魯士藍(lán)染色檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。待切片干燥后顯微鏡下拍片,用Leica Qwin Image Processing and Analysis軟件分析普魯士藍(lán)染色結(jié)果,測(cè)量PA、計(jì)數(shù)斑塊內(nèi)出血點(diǎn)總數(shù),計(jì)算斑塊內(nèi)校正出血點(diǎn)百分比(斑塊內(nèi)出血點(diǎn)總數(shù)/PA)。

1.10RT-q聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)主動(dòng)脈 ICAM-1 及 VCAM-1 RNA表達(dá) 裂解液裂解主動(dòng)脈,RNA提取試劑盒提取總RNA,測(cè)定其濃度和純度,按照試劑盒要求反轉(zhuǎn)錄為cDNA。ICAM-1 及 VCAM-1為目的基因,GAPDH為內(nèi)參基因,引物序列(5′→3′):GAPDH上游引物:GTTACCAGGGCTGCCTTCTC,下游:GATGGTGATGGGTTTCCCGT;ICAM-1上游引物:TTCACACTGAATGCCAGCTC,下游:GTCTGCTGAGACCCCTCTTG;VCAM-1上游引物:ATTTTCTGGGGCAGGAAGTT,下游:ACGTCAG-AACAACCGAATCC。長(zhǎng)度分別為177、182、238 bp。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火 30 s,最后72 ℃延伸30 s。

1.11Western印跡法檢測(cè)主動(dòng)脈 ICAM-1 及 VCAM-1 蛋白表達(dá) 主動(dòng)脈勻漿,試劑盒提取主動(dòng)脈總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量均一,100 ℃水浴10 min蛋白變性。聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜,加入ICAM-1(100 kD,1∶5 000)、VCAM-1(100 kD,1∶5 000)和β-actin(42 kD,1∶1 000)一抗過(guò)夜,后加入相應(yīng)二抗,顯影,凝膠成像并用分析系統(tǒng)分析。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為 0.05。

2 結(jié) 果

2.1小鼠超聲與體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 28 w結(jié)束后,超聲圖結(jié)果顯示:兩模型組主動(dòng)脈及頸動(dòng)脈均可見(jiàn)明顯斑塊形成,而同年齡段對(duì)照組無(wú)或少見(jiàn)斑塊。兩模型組高脂飲食 28 w后,體質(zhì)量較普通飲食喂養(yǎng)的相應(yīng)對(duì)照組體質(zhì)量明顯增加(均P<0.01),LM組較QM組體質(zhì)量增加更明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組體質(zhì)量、血清TC、LDL-C、HDL-C、TG、MCP-1水平比較

圖1 超聲心動(dòng)圖示各組主動(dòng)脈弓及頭臂干處斑塊

2.2各組血脂及MCP-1水平比較 由表1可知,兩模型組在高脂飲食28 w后,血清TC、 LDL-C和TG水平均明顯升高,分別和同年齡段對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。LC組血清 TG水平較QC組顯著低(P<0.01),LM組血清 TG水平較QM組顯著高(P<0.05)。LM組與QM組、LC組與QC組相比血清 HDL-C 有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比,同年齡段模型組血清 MCP-1含量均明顯升高(P<0.01);LC組與QC組相比,血清MCP-1水平顯著低(P<0.01),QM組與LM組血清MCP-1水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。

2.3各組冠狀動(dòng)脈HE染色與油紅O染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,QC組血管管壁結(jié)構(gòu)規(guī)則,內(nèi)膜平滑、中膜厚度均一,管腔完整;LC組血管管壁較疏松,管腔較完整;QM組血管管壁部分結(jié)構(gòu)凌亂、彈性膜結(jié)構(gòu)破壞,管壁內(nèi)可見(jiàn)AS斑塊,其纖維帽完整;LM組冠狀動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)明顯紊亂,管腔狹窄,彈性膜結(jié)構(gòu)明顯減少,內(nèi)膜明顯增厚。兩對(duì)照組均無(wú)斑塊形成,LM組較LC組主動(dòng)脈根部水平斑塊面積及脂質(zhì)含量明顯增大(均P<0.01)。油紅O染色顯示,與對(duì)照組相比,兩年齡段模型組冠狀動(dòng)脈斑塊中均有大量脂質(zhì)沉積。LM組與QM組相比,冠狀動(dòng)脈斑塊中斑塊脂質(zhì)含量少(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組斑塊面積和斑塊脂質(zhì)含量比較

圖2 各組冠狀動(dòng)脈形態(tài)

2.4兩模型組冠狀動(dòng)脈斑塊中膠原纖維含量、CD68、MMP9及出血點(diǎn)的表達(dá)差異 Masson染色顯示兩模型組冠狀動(dòng)脈斑塊中均有大量膠原纖維沉積,且LM組較QM組冠狀動(dòng)脈斑塊中膠原纖維含量百分比明顯減少(P<0.05)。免疫組化染色顯示,LM組冠狀動(dòng)脈斑塊中CD68及MMP9含量與QM組相比顯著增高(均P<0.01)。普魯士藍(lán)染色顯示QM組冠狀動(dòng)脈斑塊出血點(diǎn)百分比較LM組明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表3、圖3。

表3 兩模型組冠狀動(dòng)脈斑塊膠原纖維、CD68、MMP9含量和出血點(diǎn)比較

圖3 兩模型組冠狀動(dòng)脈Masson、CD68、MMP9和Perls染色(×400)

2.5各組主動(dòng)脈組織中 ICAM-1 及 VCAM-1表達(dá)差異 與同年齡段對(duì)照組相比,LM組與QM組冠狀動(dòng)脈 ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01,P<0.05);ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)在QM組與LM組、QC組與LC組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。ICAM-1蛋白表達(dá)在QM組與LM組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),VCAM-1 蛋白表達(dá)在LM組與QM組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表4、圖4。

表4 各組主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖4 Western印跡檢測(cè)各組主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)

3 討 論

全球老年化人口在未來(lái)幾十年中將大幅增長(zhǎng),預(yù)測(cè)到2050年,65歲以上的人數(shù)將翻一番,這提示與年齡有關(guān)疾病將出現(xiàn)不可避免的激增〔5〕。衰老被認(rèn)為是一種慢性無(wú)菌低度炎癥狀態(tài)(也被稱(chēng)為炎癥性衰老),在大多數(shù)慢性退行性疾病(包括老年性心血管疾病和腦血管疾病)的發(fā)展中起重要作用〔1〕。眾多炎癥細(xì)胞參與AS進(jìn)程,而其中具有清道夫之稱(chēng)的單核/巨噬細(xì)胞更是參與了 AS 的全程,在AS早期階段,其可通過(guò)攝取正常和氧化修飾性的脂蛋白減輕局部損害,但隨著胞內(nèi)脂質(zhì)增多,其逐漸轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞,單核/巨噬細(xì)胞原有細(xì)胞表型和功能也發(fā)生了改變〔6,7〕,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化對(duì)冠狀動(dòng)脈AS斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞 CD68 進(jìn)行定位定量分析,發(fā)現(xiàn)衰老對(duì)AS斑塊內(nèi)炎細(xì)胞的聚集有促進(jìn)作用。MCP-1表達(dá)增多可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞向血管壁局部病變定向遷移、浸潤(rùn)及活化,活化的巨噬細(xì)胞可進(jìn)一步分泌炎癥因子促進(jìn)AS 的進(jìn)展,與冠心病密切相關(guān)〔8〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),MCP-1水平與 AS的形成密切相關(guān),但在同等高脂飲食條件下不同年齡小鼠MCP-1 水平尚不足以形成顯著差異。

ICAM-1和 VCAM-1 是介導(dǎo)炎細(xì)胞黏附的兩個(gè)重要黏附分子。研究表明,ICAM-1、 VCAM-1等高表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞在斑塊中大量增殖積累,增加斑塊不穩(wěn)定性〔9〕。研究發(fā)現(xiàn),老年大鼠(24月齡)血清中的ICAM-1和VCAM-1都顯著高于青年大鼠(6月齡),這表明這些黏附分子的系統(tǒng)性表達(dá)可能會(huì)增加炎癥性血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí),隨著年齡增大,小鼠ICAM-1和VCAM-1 mRNA 表達(dá)增加,支持了 ICAM-1、VCAM-1 是參與AS 形成的主要事件之一的觀點(diǎn),但關(guān)于 VCAM-1 的年齡相關(guān)性變化仍不明確。Fotis等〔11〕研究證實(shí),高膽固醇飲食可誘導(dǎo) Wistar 大鼠主動(dòng)脈中 ICAM-1 的表達(dá)增加,而對(duì) AS 早期階段 VCAM-1 的表達(dá)無(wú)明顯影響,這提示主動(dòng)脈中ICAM-1表達(dá)可能是AS病變的早期事件,而VCAM-1可能在AS后期表達(dá),這也與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,而LM組冠狀動(dòng)脈 VCAM-1 蛋白表達(dá)與LC組比有升高趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異,考慮與冠狀動(dòng)脈組織蛋白提取時(shí)混有部分心肌蛋白相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn),老年模型組斑塊中MMP9表達(dá)增高。研究表明,MMPs 在易損 AS 斑塊進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用〔9〕,其中MMP9更是調(diào)節(jié)動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)含量的主要成分,其可降解細(xì)胞外基質(zhì),并促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移〔12〕,其活性失衡可以導(dǎo)致血管的病理性改變。Masson染色結(jié)果與MMP9的結(jié)果相符合。結(jié)合HE 染色結(jié)果,本研究提示,斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積與斑塊大小呈正相關(guān),且年齡對(duì)其有一定的促進(jìn)作用。另發(fā)現(xiàn),兩模型組小鼠冠狀動(dòng)脈 AS 斑塊內(nèi)出血點(diǎn)密度有差異,但以青年模型組較多,即青年模型組小鼠較老年模型組小鼠冠狀動(dòng)脈 AS 斑塊更易出血,但其原因仍不清楚,可能與血管新生的能力隨年齡增加而減弱有關(guān)。

綜上所述,老年與青年 ApoE-/-小鼠冠狀動(dòng)脈AS斑塊組織形態(tài)學(xué)及穩(wěn)定性相關(guān)指標(biāo)存在差異,這表明在相同環(huán)境下,老年與青年ApoE-/-小鼠AS病變進(jìn)程也并不完全相同。老年ApoE-/-小鼠AS斑塊的不穩(wěn)定性主要與內(nèi)外膜炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān),而青年 ApoE-/-小鼠AS斑塊的不穩(wěn)定性則主要與斑塊內(nèi)出血密切相關(guān)。至于斑塊內(nèi)出血在青年鼠冠狀動(dòng)脈AS斑塊中更突出的原因尚有待進(jìn)一步研究。