丹珠永吉 劉芝蘭 逯艷艷 蔣漢梅

(1青海省人民醫(yī)院消化內(nèi)科,青海 西寧 810000;2青海大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一〔1,2〕,發(fā)病率及病死率較高,晚期胃癌5年生存率不足20%〔3〕。腫瘤細(xì)胞免疫治療是目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)〔4〕,嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)治療在血液系統(tǒng)腫瘤治療方面取得了振奮人心的療效〔5〕,也有學(xué)者研究其在實(shí)體腫瘤中的治療效果〔6〕?，F(xiàn)已證實(shí)表皮生長因子受體(EGFR)與胃癌患者預(yù)后生存密切相關(guān),EGFR靶向藥物在臨床工作中已廣泛應(yīng)用〔7〕。靶向EGFR的CAR-T將抗原抗體結(jié)合的特異性與T細(xì)胞毒性相結(jié)合,有望成為晚期胃癌治療的新方向。本研究通過構(gòu)建靶向EGFR的CAR-T質(zhì)粒,探討對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用,以期為胃癌分子靶向治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI1640、胎牛血清(FBS,GIBCO公司,美國)、限制性內(nèi)切酶BamHI、NcoI(Axygen公司,美國),人淋巴細(xì)胞分離液(GE公司,美國)、DNA鏈接酶(TaKaRa公司,日本)、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒、PL-CD-19-28TM-28BBζ質(zhì)粒(上海生工生物公司)、胃癌SGC-7901細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.2抗EGFR嵌合抗原受體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的制備:抽取胃癌患者外周血2 ml,肝素抗凝,生理鹽水稀釋,加入淋巴細(xì)胞分離液Ficoll,2 000 r/min,室溫離心30 min,收集離心后上層與中層之間的單個(gè)核細(xì)胞層,制備單個(gè)核細(xì)胞懸液。全基因合成EGFR單克隆抗體單鏈抗體(ScFv)序列,并加上BamHI、NcoI酶切位點(diǎn)。將合成的ScFv片段及PL-CD-19-28TM-28BBζ質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶酶切后,分別切膠回收合成片段和載體片段,16 ℃連接反應(yīng)3 h(包含酶切產(chǎn)物2 μl,T4DNA連接酶1 μl),挑選陽性克隆的質(zhì)粒。將逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝載體Peqpam3和質(zhì)?；靹?加入外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),加入10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)12 d左右,收集T細(xì)胞備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3流式細(xì)胞儀檢測靶向EGFR的CAR-T對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷作用 將生長狀態(tài)良好的胃癌SGC-7901細(xì)胞胰酶消化,離心收集,加入EGFR抗體,室溫孵育30 min后,流式細(xì)胞儀檢測胃癌SGC-7901細(xì)胞EGFR的陽性表達(dá)情況,收集培養(yǎng)狀態(tài)良好的EGFR(+)的胃癌SGC-7901細(xì)胞,將CAR-T與胃癌SGC-7901細(xì)胞混合培養(yǎng)4 h,效靶比分別為10∶1、5∶1、1∶1,分別記為10∶1組、5∶1組、1∶1組,加入CellTraceTMCFSE、FarRed示蹤新型染料,使其分別在異硫氰酸熒光素(FITC)、腫瘤抑制基因(APC)通道激發(fā)出熒光,檢測FITC、APC通道中激發(fā)出熒光細(xì)胞的比例,以未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞為對(duì)照(control組)。

1.4乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)檢測CAR-T對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷作用 將濃度1×104/孔的CAR-T和EGFR(+)或EGFR(-)胃癌SGC-7901細(xì)胞(效靶比5∶1)200 μl接種于96孔板中混合培養(yǎng),培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2共培養(yǎng)0、12、24 h(分別為0 h組、12 h組、24 h組),加入20 μl乳酸脫氫酶釋放試劑,培養(yǎng)箱孵育1 h后4 000 r/min離心5 min后,取上清液100 μl,加入50 μl乳酸脫氫酶檢測工作液,室溫孵育30 min,檢測490 nm處光密度值,殺傷率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測IFN-γ、IL-2的表達(dá) 將濃度1×104/孔效能分別為10∶1、5∶1、1∶1的CAR-T與EGFR(+)胃癌SGC-7901細(xì)胞100 μl接種于96孔板中混合培養(yǎng)4 h,分別作為10∶1組、5∶1組、1∶1組,加入干擾素(IFN)-γ、白細(xì)胞介素(IL)-2抗體,4 ℃過夜,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入生物素標(biāo)記的檢測抗體,酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1流式細(xì)胞儀CAR-T對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷作用 與control組〔(0.00±0.00)%〕和1∶1組〔(0.42±0.05)%〕比較,5∶1組〔(3.29±1.26)%〕和10∶1組細(xì)胞凋亡率〔(3.84±1.17)%〕升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.54,P<0.001);10∶1組細(xì)胞凋亡率高于5∶1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.262,P<0.05)。見圖1。

2.2乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)檢測CAR-T對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷作用 CAR-T、EGFR(+)胃癌SGC-7901細(xì)胞共培養(yǎng)0、12、24 h后,CAR-T對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷作用,隨著時(shí)間的延長顯著增加,兩兩比較細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CAR-T、EGFR(-)胃癌SGC-7901細(xì)胞共培養(yǎng)0、12、24 h后細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡水平比較

2.3ELISA檢測IFN-γ、IL-2的表達(dá) 5∶1組、10∶1組IFN-γ、IL-2水平高于1∶1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10∶1組IFN-γ、IL-2水平高于5∶1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組IFN-γ、IL-2水平比較

3 討 論

近年來我國胃癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,但多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期,雖然隨著胃癌臨床綜合治療的進(jìn)步,病死率逐年降低,但晚期胃癌患者預(yù)后仍不甚理想〔8,9〕。以EGFR/人表皮生長因子受體(HER)2等小分子為靶點(diǎn)的靶向藥物在胃癌治療中也取得了不錯(cuò)的療效,但亦有研究顯示部分胃癌患者未能獲益〔10～13〕,表明EGFR在胃癌發(fā)生發(fā)展中的病理機(jī)制中仍有待于進(jìn)一步研究。

腫瘤免疫治療就是通過重新啟動(dòng)并維持腫瘤-免疫循環(huán),恢復(fù)機(jī)體正常的抗腫瘤免疫反應(yīng),從而達(dá)到抗腫瘤作用,包括單克隆抗體類免疫檢查點(diǎn)抑制劑、治療性抗體、癌癥疫苗、細(xì)胞治療和小分子抑制劑等〔14,15〕。但由于腫瘤細(xì)胞免疫原性差、腫瘤患者免疫功能低下等原因,胃癌患者T細(xì)胞很難起到殺傷腫瘤細(xì)胞作用〔16〕。腫瘤過繼免疫治療是通過基因工程將表達(dá)靶向腫瘤特異性抗原的嵌合抗原受體T細(xì)胞輸至患者體內(nèi),以增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用〔17〕。目前CAR-T在血液系統(tǒng)腫瘤及胰腺癌、肺 癌等惡性實(shí)體瘤治療中已廣泛開展〔18,19〕。

EGFR是原癌基因C-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物,通過與配體表皮生長因子結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲,研究報(bào)道EGFR在胃癌組織中過表達(dá),與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)〔20,21〕。本研究結(jié)果顯示,EGFR(+)胃癌SGC-7901細(xì)胞能誘導(dǎo)CAR-T釋放IFN-γ、IL-2,且具有濃度依賴,與以前的研究〔20,21〕結(jié)果相似。

EGFRⅢ是EGFR基因產(chǎn)物之一,僅在惡性治療細(xì)胞中表達(dá),而在正常組織中無表達(dá)〔22〕,因此,靶向EGFR的CAR-T對(duì)惡性實(shí)體瘤治療具有重要意義。有學(xué)者對(duì)11例難治性非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行靶向EGFR的CAR-T臨床研究,結(jié)果顯示2例部分緩解,5例病情穩(wěn)定〔23〕,表明靶向EGFR的CAR-T在實(shí)體腫瘤的治療中具有重要價(jià)值。

綜上,本研究成功構(gòu)建了靶向EGFR的嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞,通過釋放IFN-γ、IL-2對(duì)EGFR陽性的胃癌SGC-7901細(xì)胞起到了殺傷作用,為胃癌的免疫治療奠定基礎(chǔ)。