劉仁帥 羅憫 殷梅

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,云南 昆明 650101)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是一種與睡眠相關(guān)的常見呼吸障礙〔1〕。作為 OSAS的常見并發(fā)癥,認(rèn)知障礙近年來備受關(guān)注〔2〕。OSAS對認(rèn)知功能的影響包括注意力和警覺性降低、記憶力和學(xué)習(xí)能力受損、精神運(yùn)動功能失衡、情緒調(diào)節(jié)紊亂和執(zhí)行功能下降等〔3〕。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管化、炎癥和神經(jīng)保護(hù)的關(guān)鍵因素〔4〕,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞與OSAS患者神經(jīng)炎癥的發(fā)展和維持有關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞特別容易因腦損傷和炎癥或免疫刺激而被激活,并在激活后發(fā)生顯著的形態(tài)學(xué)改變,從靜止的分枝小膠質(zhì)細(xì)胞變成激活的似變形蟲的小膠質(zhì)細(xì)胞。在這個激活過程中,它們的表面分子(如補(bǔ)體受體、細(xì)胞因子、趨化因子等)將上調(diào),同時,具有促炎性和潛在細(xì)胞毒性的多種可溶性因子,釋放激活的小膠質(zhì)細(xì)胞〔5～7〕通過受損的線粒體、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和產(chǎn)生過量一氧化氮來誘導(dǎo)強(qiáng)大的氧化應(yīng)激反應(yīng)〔8〕,從而加重慢性間歇性缺氧(CIH)損傷,導(dǎo)致認(rèn)知障礙。作為OSAS最重要的病理生理過程,CIH會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)性神經(jīng)元損傷和功能障礙,這很可能與海馬體有關(guān)〔9〕,但具體機(jī)制尚不完全清楚。本研究建立OSAS大鼠動物模型,觀察海馬CA1區(qū)病理變化及小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況,尋找OSAS認(rèn)知障礙可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑 多參數(shù)神經(jīng)監(jiān)護(hù)儀(上海諾誠醫(yī)療器械公司);Morris水迷宮(成都盟泰科技有限公司);組織脫水機(jī)(闊?？萍?KH-TK);石蠟包埋機(jī)(Leica EG1160,德國);石蠟切片機(jī)(Leica RM2135,德國);冰凍切片機(jī)(Leica CM 1900,德國);數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)(CellSens Standard);10 mg/ml玻璃酸透明質(zhì)酸鈉凝膠(上海其勝生物制劑公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,北京中杉 ZLI-9061);Tween 20(Sigma-vetec);聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100,Vetec V900502);檸檬酸鹽修復(fù)液(北京中杉金橋);蘇木素(Sigma H3136);伊紅(Sigma 230251);石蠟(Leica H22149);二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色試劑盒(北京中杉ZLI-9018);封閉用正常羊血清(北京中杉ZLI-9021);通用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋);離子鈣接頭蛋白抗原(IBA)-1(wako日本 rabbit)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量280～300 g,購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部〔生產(chǎn)許可證:SCXK(滇)K2015-0002)〕,在昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物樓標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng),保證實(shí)驗(yàn)大鼠正常生活習(xí)性。本實(shí)驗(yàn)得到昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3實(shí)驗(yàn)動物及分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)后采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組各30只。對照組采用正常飼養(yǎng)模式,實(shí)驗(yàn)組采用咽腔多點(diǎn)注射透明質(zhì)酸鈉凝膠制備OSAS模型。

1.4OSAS動物模型制作 根據(jù)周趙德等〔10〕方法,(1)SD大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,使用多參數(shù)神經(jīng)監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測血氧飽和度并記錄數(shù)據(jù)(具體方法為:按3 ml/kg的劑量配制10%水合氯醛,對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉;成功后,將血氧探頭的紅外線充分接鼠尾靜脈,待儀器上參數(shù)穩(wěn)定后記錄每只大鼠的最低血氧飽和度和平均血氧飽和度)。(2)實(shí)驗(yàn)組模型制備方法為:麻醉方法同以上,于雙側(cè)舌腭弓、咽腭弓及舌根處多點(diǎn)少量注射醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠(約3 ml),整個過程注意觀察大鼠呼吸情況。小心監(jiān)測大鼠生命體征,直至大鼠麻醉完全清醒,避免窒息死亡。分別于術(shù)前1 w及術(shù)后4 w使用多參數(shù)神經(jīng)監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測最低血氧飽和度及平均血氧飽和度,并與術(shù)前數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(3)實(shí)驗(yàn)分組:30只模型組大鼠造模成功后,按繼續(xù)飼養(yǎng)時間分為實(shí)驗(yàn)2、4、6 w組,每組10只,與對照組相對應(yīng)。

1.5Morris水迷宮試驗(yàn)行為學(xué)評估 ①定位航行實(shí)驗(yàn):第1～6天對大鼠進(jìn)行水迷宮檢測,第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)開始時小平臺放置于第三象限且在水面下1～2 cm。將兩組大鼠分別在每個象限的中點(diǎn)面朝池壁置放入水槽,同時啟動計(jì)算機(jī)跟蹤程序,記錄每組大鼠在水迷宮中找到水下平臺所花費(fèi)的時間、路程,超過90 s未找到平臺時其潛伏期記為90 s,同時實(shí)驗(yàn)者用小棍指引大鼠尋找到平臺,并允許其在小平臺上停留10 s。取每只大鼠的平均成績作為空間學(xué)習(xí)能力的指標(biāo),連續(xù)觀測6 d。②空間探索實(shí)驗(yàn):第7天將小平臺撤去,分別在四個象限的固定點(diǎn)將大鼠放入水池,記錄大鼠在目標(biāo)象限的時間及穿過原平臺所在位置的次數(shù),將此作為空間記憶的檢測指標(biāo)。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變 所有大鼠脫頸處死后,快速分離海馬組織并制備石蠟切片,將切片在二甲苯中脫蠟10 min,然后在降序的乙醇(100%、95%、85%和70%)和蒸餾水中再水合5 min。切片用0.1% HE溶液染色,然后在95%和100%乙醇中逐漸脫水2次,每次5 min。處理脫水后,中性樹膠封片,普通光學(xué)顯微鏡下觀察顯色結(jié)果并拍照。

1.7免疫組組織化學(xué)(IHC)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA-1的陽性表達(dá) 將切片置于溫度為65 ℃恒溫烘箱中至少30 min,常規(guī)梯度乙醇脫蠟至水,0.01 mol/L PBS漂洗,將腦組織切片浸入3%過氧化氫(H2O2)溶液在室溫下放置30 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后將組織切片置于檸檬酸鹽緩沖液中在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。在室溫下再加入正常山羊血清1 h以阻斷非特異性結(jié)合,加適當(dāng)濃度一抗,4 ℃過夜。PBS洗滌20 min后,組織切片與二抗(PV9000試劑)37 ℃孵育30 min。然后去除多余的二抗,再用PV9000試劑25 ℃孵育1 h,PBS漂洗后用DAB染色5～10 min。顯微鏡下觀察顯色情況并記錄顯色時間,然后將組織切片用蘇木素復(fù)染,烘干,二甲苯透明10 min,中性樹膠封片,照片采集。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行自身配對設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)、重復(fù)測量方差分析、單因素方差分析及Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1造模成功判斷 造模后實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)活動減少、呼吸費(fèi)力、呼吸頻次增快、抬頭呼吸、腹式呼吸加深,可聞及呼吸打鼾聲等類似OSAS癥狀。對照組性情溫順、呼吸正常、活動及飲食正常。實(shí)驗(yàn)組造模后最低血氧飽和度及平均血氧飽和度均較造模前降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示造模成功。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組造模前后最低血氧飽和度和平均血氧飽和度

2.2Morris水迷宮行為學(xué)結(jié)果

2.2.1定位航線實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組2、4、6 w平均潛伏期較對照組延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨著實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)時間延長,潛伏期逐漸延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明實(shí)驗(yàn)組學(xué)習(xí)能力明顯受損。見表2。

表2 兩組不同培養(yǎng)時間平均潛伏時間及穿越平臺次數(shù)比較

2.2.2空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組2、4、6 w穿越平臺次數(shù)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)時間延長,其穿越平臺次數(shù)逐漸減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的空間定位記憶缺陷。見表2。

2.3各組海馬HE染色結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組2、4、6 w神經(jīng)元變性壞死計(jì)數(shù)與對照組同期比較明顯增加(均P<0.05)。見表3。對照組各時間點(diǎn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,大小形狀正常,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,細(xì)胞輪廓及邊界清晰,細(xì)胞排列致密、整齊,核仁明顯且核質(zhì)分明,有少量異染色質(zhì)。對照組各期海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)核固縮,細(xì)胞排列松散、紊亂,邊界不清,細(xì)胞周圍間隙增寬,形態(tài)不規(guī)則。隨著OSAS時間延長,神經(jīng)元數(shù)量減少,細(xì)胞變形、壞死細(xì)胞逐漸增多,細(xì)胞核模糊。亦可見細(xì)胞空泡化,胞質(zhì)成分不明顯。見圖1。

圖1 HE染色觀察兩組不同培養(yǎng)時間海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)(×40)

表3 各組不同培養(yǎng)時間海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性壞死計(jì)數(shù)及IBA-1表達(dá)比較

2.4免疫組化觀察兩組海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA-1表達(dá) 圖2可知,對照組2、4、6 w可見靜息期小膠質(zhì)細(xì)胞,表現(xiàn)為:數(shù)量少,染色淺,細(xì)胞體小而長,可見有伸向各個方向的呈分枝狀細(xì)長的突起。實(shí)驗(yàn)組2、4、6 w,可見激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞突起增粗,細(xì)胞深染,細(xì)胞體變大、膨脹。實(shí)驗(yàn)組2、4、6 w IBA-1的IOD值與對照組同期比較明顯增加(P均<0.05)。見表3。

圖2 兩組培養(yǎng)不同時間海馬CA1區(qū)IBA-1表達(dá)[×200;小框所指為箭頭處局部放大的IBA-1小膠質(zhì)細(xì)胞(×400)]

2.5海馬神經(jīng)損傷與行為學(xué)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化的相關(guān)性 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性壞死細(xì)胞數(shù)與Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)第5天逃避潛伏期時間呈顯著正相關(guān)(r=0.848,P<0.05),與Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)第5天空間探索數(shù)據(jù)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.820,P<0.05)。海馬神經(jīng)損傷與小膠質(zhì)細(xì)胞活化:海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性壞死細(xì)胞數(shù)與海馬CA1區(qū)IBA-1免疫組化染色結(jié)果呈顯著正相關(guān)(r=0.774,P<0.05)。

3 討 論

CIH是OSAS的主要病理特征,而間歇性缺氧和睡眠碎片化可以影響成人海馬神經(jīng)元,患有OSAS并發(fā)癥的老年患者可能會加速腦萎縮、認(rèn)知能力下降及癡呆的發(fā)生。有證據(jù)提示,OSAS動物模型中的CIH與空間學(xué)習(xí)受損有關(guān),這與皮層和海馬CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡增加及神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)〔11～13〕。OSAS致認(rèn)知障礙的機(jī)制包括CIH、氧化應(yīng)激、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂及神經(jīng)炎癥等,其中神經(jīng)炎癥的變化,與小膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)〔9,14〕。已經(jīng)有動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),CIH導(dǎo)致小鼠背側(cè)海馬體的輕度神經(jīng)炎癥,包括早期炎性細(xì)胞因子升高、后期小膠質(zhì)細(xì)胞變化及對脂多糖炎癥挑戰(zhàn)的細(xì)胞因子反應(yīng)改變。這些變化可能會導(dǎo)致CIH誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙和病理性腦老化〔15〕。已知在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被細(xì)胞因子激活并分化為促炎(M1)或抗炎(M2)譜。細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-5、腫瘤壞死因子(TNF)-α和γ-干擾素(IFN-γ)通常負(fù)責(zé)激活小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入促炎M1譜以清除病原體和受損組織,并激活凋亡途徑。而IL-4、IL-10和IL-13細(xì)胞因子促使小膠質(zhì)細(xì)胞分化為抗炎M2譜以促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制炎癥通路。然后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會釋放與其特征一致的細(xì)胞因子,以進(jìn)一步誘導(dǎo)額外的免疫反應(yīng)。在穩(wěn)態(tài)條件下,這些激活的細(xì)胞因子被平衡以維持細(xì)胞健康。然而,這些互補(bǔ)譜的失調(diào)可能由炎癥系統(tǒng)的慢性激活引起〔16,17〕,這些可通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索。目前,對結(jié)構(gòu)神經(jīng)元損傷的機(jī)制及小膠質(zhì)細(xì)胞在OSAS暴露于CIH期間所起的潛在作用知之甚少。CIH引發(fā)了諸如海馬細(xì)胞凋亡和學(xué)習(xí)缺陷等病理。根據(jù)大量嚙齒動物模型累積證據(jù)證實(shí),CIH確實(shí)會誘導(dǎo)大腦中的異位損傷模式,特別是影響皮質(zhì)、皮質(zhì)下和海馬區(qū)域,最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞激活〔18〕。氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥對小膠質(zhì)細(xì)胞具有負(fù)面機(jī)制影響,導(dǎo)致其凋亡。受損的小膠質(zhì)細(xì)胞會釋放大量促炎細(xì)胞因子,進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)。一般來說,炎癥的適度激活有利于神經(jīng)保護(hù),但過度時會導(dǎo)致神經(jīng)毒性。因此,保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞免受炎癥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是緩解神經(jīng)炎癥的一種策略〔19〕。近年來,越來越多的研究表明,線粒體自噬是一種內(nèi)在的抗炎機(jī)制,可啟動功能失調(diào)的線粒體的清除并限制過度的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生,最終抑制神經(jīng)炎癥〔20〕。已有研究證實(shí),通過使用抗氧化及抗炎類藥物,如芝麻酚等可降低海馬體神經(jīng)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),減輕CIH大鼠認(rèn)知障礙〔21,22〕。

綜上,OSAS模型大鼠致認(rèn)知障礙可以導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理損害,同時引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,可能與神經(jīng)炎癥有關(guān),表明神經(jīng)炎癥相關(guān)通路可能參與OSAS致認(rèn)知障礙的過程中,抗神經(jīng)炎癥可能成為OSAS海馬損傷的治療方法之一。