蔡昭皓 張貴金 王列 萬聰 郭莉

(都江堰市第二人民醫(yī)院,四川 成都 611830)

腦出血病理機(jī)制尚未完全闡明,臨床上尚缺乏根治性的治療措施。盡管腦出血患者的救治成功率有了較為明顯的提高,但是患者在預(yù)后的記憶、神經(jīng)、行動障礙方面的恢復(fù)仍不能令人滿意,嚴(yán)重影響患者和其家庭的生活質(zhì)量〔1〕。大量研究顯示〔2〕,腦出血后繼發(fā)性的腦損傷是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。在原發(fā)性腦組織損傷的基礎(chǔ)上,患者腦組織出現(xiàn)由神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、炎性應(yīng)激、紅細(xì)胞裂解物毒性作用等導(dǎo)致的一系列的繼發(fā)性的水腫性的生理病理過程被稱為繼發(fā)性腦損傷。因此防治或緩解腦出血后的繼發(fā)性腦損傷是神經(jīng)外科領(lǐng)域急需解決的難題之一。研究顯示〔3〕,繼發(fā)性腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的腦組織結(jié)構(gòu)改變是患者預(yù)后神經(jīng)記憶功能障礙的主要原因。而腦出血后紅細(xì)胞裂解,導(dǎo)致腦組織鐵離子沉積是腦損傷加重的主要因素之一,諸多研究以此為藥物干預(yù)靶點(diǎn),其中鐵螯合劑(去鐵胺)應(yīng)用較多。Guo等〔4〕研究顯示,去鐵胺能明顯減輕實(shí)驗(yàn)動物的腦損傷,改善動物的神經(jīng)功能缺損程度。但有關(guān)去鐵胺在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用的報道較少。神經(jīng)元細(xì)胞的骨架是腦組織細(xì)胞維系穩(wěn)定形態(tài)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。腦組織海馬區(qū)是進(jìn)行學(xué)習(xí)、記憶等行為的關(guān)鍵部位,同時也是繼發(fā)性腦損傷時的易損區(qū)。海馬神經(jīng)元樹突標(biāo)志物微管結(jié)合蛋白(MAP)2和β-微管蛋白(Tubulin)是海馬區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行突觸傳遞的骨架基礎(chǔ)〔5〕。本研究探討去鐵胺對大鼠腦組織的保護(hù)作用及對海馬區(qū)骨架蛋白表達(dá)影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物、試劑及儀器 10～12周齡,SPF級,體質(zhì)量320～360 g,雄性SD大鼠60只,購自四川省疾病預(yù)防控制中心〔動物使用許可證號SYXK(川)2020-229〕。所有大鼠先在SPF基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動物中心適應(yīng)性喂養(yǎng),22～25 ℃下,濕度50%～60%,12 h明暗周期交替,標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水與攝食;本研究經(jīng)醫(yī)院的動物倫理委員會核定,實(shí)驗(yàn)方案中涉及動物的操作均最大限度減少動物的疼痛,在實(shí)驗(yàn)操作過程中盡可能減少動物的傷亡。主要試劑:甲磺酸去鐵胺(0.5 g×10瓶/盒,德國Wasserburger Arzneimittelwerk GmbH公司,批號:202007-9UTH),毗拉西坦片(0.4 g×100片,廣東華南藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字:H44020779),Ⅶ型膠原酶(澳大利亞Gibco公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色試劑盒、免疫組化、Western印跡試劑盒(北京中杉金橋有限公司),磷酸鹽緩沖液(PBS,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。主要儀器:低溫石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司),光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司),凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽(美國Bio-Rad公司),超凈工作動臺(江蘇榮華儀器制造有限公司),JEM-3300透射電鏡(日本電子株式會社),BXS-201大鼠跳臺試驗(yàn)儀(北京北廣精儀儀器設(shè)備有限公司),BA-200避暗自動測試儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.2腦出血大鼠模型的復(fù)制及實(shí)驗(yàn)分組處理 實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、對照組、去鐵胺(低、中、高劑量)組,每組10只;參考Song等〔6〕方法制備腦出血大鼠模型:腹腔注射65 mg/kg的戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后,固定后,在頭皮的中線上,做一切口(位置:中線右側(cè)3.0 mm,前囟后0.2 mm,顱骨下方6.0 mm),鉆一毛刺孔,用微量注射泵注入2.5 μl膠原酶Ⅶ,封閉切口,消毒,靜置大鼠待其復(fù)蘇;假手術(shù)組只進(jìn)行切口,但不進(jìn)行注射;術(shù)后2 h后,進(jìn)行Berderson評分〔7〕,Berderson評分在1級以上視為造模成功的標(biāo)準(zhǔn);Berderson評分標(biāo)準(zhǔn):0級:沒有神經(jīng)功能缺失;1級:提起大鼠尾部后,大鼠側(cè)前肢回收并彎曲收在腹下;2級:提起大鼠尾部后,大鼠身體明顯蜷曲;3級:除以上癥狀外,大鼠身體明顯出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)的狀態(tài);評定完畢后,剔除不符合要求的動物,并及時重新造模補(bǔ)充動物。造模成功4 h后,對照組大鼠以21.6 mg/kg毗拉西坦生理鹽水溶液進(jìn)行灌胃處理,去鐵胺(低、中、高劑量)組分別以50、100、200 mg/kg去鐵胺進(jìn)行灌胃處理,假手術(shù)組和模型組每日以生理鹽水進(jìn)行灌胃給藥,連續(xù)給藥4 w。在實(shí)驗(yàn)過程中每只大鼠,單籠飼養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水與攝食。

1.3各組記憶功能的檢測 在實(shí)驗(yàn)過程中觀察記錄各組大鼠一般狀態(tài),在結(jié)束給藥后,留取各組大鼠5 ml靜脈血,再通過大鼠跳臺試驗(yàn)儀、避暗自動測試儀進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練,次日進(jìn)行檢測,記錄大鼠的潛伏時間(大鼠第一次跳下跳臺后進(jìn)入暗室的時間)和錯誤次數(shù)(大鼠5 min內(nèi)跳下跳臺的次數(shù))。檢測完畢后,處死各組大鼠,無菌剝離大鼠的腦組織,將右側(cè)大腦半球立即稱重(濕質(zhì)量),在置于120 ℃的烤箱中24 h,再次稱重(干質(zhì)量),腦組織的含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.4尼式染色檢測各組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的活性 取腦組織制成冠狀切片,脫蠟,再水化后,將載玻片在甲苯胺藍(lán)溶液中在 50～60 ℃下染色40 min。在蒸餾水中澄清后,經(jīng)梯度乙醇脫水后,置于二甲苯中5 min,并在蓋玻片上涂中性香脂。 最后,Image Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計分析視野中存活神經(jīng)元的數(shù)量。

1.5電鏡檢測各組腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化 取各組大鼠的腦組織,置于2.5%戊二醛中室溫下過夜,PBS清洗,梯度濃度乙醇及無水丙酮進(jìn)行脫水,包埋,切片,鈾鉛雙染色,透射電鏡下觀察。

1.6TUNEL染色檢測各組腦組織的細(xì)胞凋亡率 取各組大鼠的腦組織,在10%中性甲醛溶液固定后,包埋在石蠟中,切片,按照試劑盒要求進(jìn)行TUNEL染色,孵育,熒光顯微鏡下觀察,每個樣品的每張切片隨機(jī)選取5個視野,使用ImageJ圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7各組血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的含量 取各組大鼠的血清,經(jīng)離心后,按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒要求測定各組血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.8免疫組化檢測各組腦組織中海馬神經(jīng)元樹突標(biāo)志物微管結(jié)合蛋白(MAP)2和髓過氧化物酶(MPO)的表達(dá) 取各組大鼠的腦組織,在10%甲醛溶液中固定過夜后,梯度濃度乙醇脫水,包埋在石蠟中,切成5 μm薄片,并固定在載玻片上。用2.5%的正常山羊血清封閉玻片,并在4 ℃下與一抗孵育24 h。將載玻片在PBS中洗滌3次,加入二抗,用蘇木素復(fù)染,顯微鏡下觀察,并通過Image-Pro-Plus6.0圖像處理軟件統(tǒng)計目標(biāo)蛋白的陽性表達(dá)率。

1.9Western印跡檢測各組腦組織中記憶儲存蛋白一般調(diào)控阻遏蛋白激酶(GCN)2和β-微管蛋白(Tubulin)表達(dá) 取各組腦組織樣品加入RIPA蛋白裂解液,提取樣本中總蛋白,Bradford試劑盒測定濃度,進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)模,清洗,封閉,孵育,加入一抗(1∶500),孵育過夜,加入二抗(1∶1 000),顯色,以GAPDH作為內(nèi)參統(tǒng)計分析各條帶灰度值。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組造模后一般狀態(tài)及腦組織含水量比較 實(shí)驗(yàn)中未發(fā)生大鼠死亡的現(xiàn)象。假手術(shù)組活動敏捷,反應(yīng)機(jī)警,皮毛柔順有光澤,飲水與進(jìn)食未見異常,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠體質(zhì)量增加明顯;模型組精神不振,四肢無力,前爪肌肉無彈性,后肢支撐力弱,行走緩慢,時常原地轉(zhuǎn)圈,活動量銳減,喜好扎堆,身體蜷縮明顯,不思飲食,飲水次數(shù)明顯減少,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后體質(zhì)量增加不明顯;與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組臨床癥狀明顯改善,活動量及飲水與進(jìn)食意愿明顯好轉(zhuǎn),尤以對照組與高劑量組改善程度最明顯;與假手術(shù)組相比,模型組、對照組、去鐵胺低、中、高劑量組腦組織含水量明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組腦組織中的含水量明顯降低(均P<0.05),并有明顯劑量依賴性(均P<0.05),高劑量組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組腦組織含水量、記憶功能參數(shù)、神經(jīng)元細(xì)胞的活性、細(xì)胞凋亡率比較

2.2各組記憶功能參數(shù)的比較 與假手術(shù)組相比,模型組、對照組、去鐵胺低、中、高劑量組記憶潛伏時間明顯下降,錯誤次數(shù)明顯升高(均P<0.05),與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組記憶潛伏時間明顯升高,錯誤次數(shù)明顯下降(均P<0.05),并有明顯劑量依賴性(均P<0.05),高劑量組和對照組差異無統(tǒng)計意義(P>0.05),見表1。

2.3尼式染色檢測各組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的活性 假手術(shù)組海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,多層椎體細(xì)胞整齊排列,胞質(zhì)被染成深藍(lán)色,尼式小體數(shù)量豐富,神經(jīng)元細(xì)胞的樹突結(jié)構(gòu)無異常;模型組海馬區(qū)椎體細(xì)胞數(shù)量銳減,排列散亂無章,胞質(zhì)著色明顯變淺,尼式小體數(shù)量減少,結(jié)構(gòu)松散;與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組海馬區(qū)尼式體損傷明顯緩解,著色逐漸變深,椎體細(xì)胞數(shù)量有所恢復(fù);與假手術(shù)組相比,模型組、對照組、去鐵胺低、中、高劑量組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的活性顯著下降(均P<0.05),與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的活性明顯升高(均P<0.05),并有明顯劑量依賴性(均P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞(尼氏染色,×400)

2.4TUNEL染色檢測各組腦組織細(xì)胞凋亡率 與假手術(shù)組相比,模型組、對照組、去鐵胺低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯降低(均P<0.05),并有明顯劑量依賴性(均P<0.05),高劑量組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1、圖2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.5電鏡觀察各組腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化 假手術(shù)組腦組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)正常,線粒體嵴結(jié)構(gòu)數(shù)量豐富,排列規(guī)整,線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)清晰可辨,核膜完整,核仁較大;模型組腦組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重,線粒體明顯腫脹,嵴結(jié)構(gòu)破壞明顯,數(shù)量銳減,基質(zhì)變深,可見大量的退化線粒體形成的髓樣小體,核膜破損嚴(yán)重,核仁明顯減小;與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組腦組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯緩解,線粒體空泡樣變性明顯減輕,嵴結(jié)構(gòu)損傷明顯緩解,細(xì)胞核的損傷程度明顯減小,尤以對照組與高劑量組最為明顯,見圖3。

圖3 電鏡觀察各組腦組織超微結(jié)構(gòu)(×5 000)

2.6各組血清中TNF-α和IL-1β含量 與假手術(shù)相比,模型組、對照組、去鐵胺低、中、高劑量組血清中TNF-α和IL-1β含量明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組血清中TNF-α和IL-1β含量明顯降低(均P<0.05),并有明顯劑量依賴性(均P<0.05),高劑量組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 各組血清中TNF-α和IL-1β含量、MAP2和MPO陽性細(xì)胞比例、GCN和β-Tubulin相對表達(dá)比較

2.7免疫組化檢測各組腦組織中MAP2和MPO的表達(dá) 與假手術(shù)組相比,模型組、對照組、去鐵胺低、中、高劑量組MAP2表達(dá)明顯下降,MPO表達(dá)明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組MAP2表達(dá)明顯升高,MPO表達(dá)明顯降低(均P<0.05),并有明顯劑量依賴性(均P<0.05),高劑量組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2、圖4。

圖4 各組MAP2、MPO表達(dá)(免疫組化,×400)

2.8各組GCN2、β-Tubulin表達(dá) 與假手術(shù)組相比,模型組、對照組、去鐵胺低、中、高劑量組GCN表達(dá)明顯升高,β-Tubulin表達(dá)明顯下降(均P<0.05);與模型組相比,對照組、去鐵胺低、中、高劑量組GCN表達(dá)明顯下降,β-Tubulin表達(dá)明顯升高(均P<0.05);并有明顯劑量依賴性(均P<0.05),高劑量組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2、圖5。

1～6:假手術(shù)組、模型組、對照組、去鐵胺低劑量組、去鐵胺中劑量組、去鐵胺高劑量組

3 討 論

遺傳、高血壓、凝血功能障礙、腦梗死、顱內(nèi)腫瘤、淀粉樣變性血管病、硬腦膜動靜脈瘺等均可誘發(fā)腦出血。臨床上常采用血腫穿刺引流術(shù)、常規(guī)大骨瓣腦血腫清除術(shù)、神經(jīng)內(nèi)鏡下血腫清除術(shù)等干預(yù)疾病的進(jìn)展。得益于醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,75%的腦出血患者能夠存活,但是繼發(fā)性腦損傷導(dǎo)致的運(yùn)動、語言、記憶和其他高級神經(jīng)功能損害,嚴(yán)重影響著患者預(yù)后的生活質(zhì)量〔8〕。

血腦屏障缺損、氧自由基的集聚、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等協(xié)同作用導(dǎo)致腦出血后的繼發(fā)性腦損傷的進(jìn)展。Wang等〔9〕研究指出,腦出血后血紅蛋白的降解及鐵元素的沉積是導(dǎo)致患者出現(xiàn)腦水腫、神經(jīng)元變性的重要機(jī)制之一。去鐵胺是臨床上應(yīng)用廣泛的鐵螯合劑。Li等〔10〕研究顯示,在創(chuàng)傷性腦損傷模型小鼠中,去鐵胺能明顯抑制動物腦組織中炎性因子TNF-α和IL-1β的釋放,緩解動物的腦組織損傷的惡化。Chen等〔11〕研究證實(shí),去鐵胺能明顯抑制急性腦梗死大鼠腦組織的神經(jīng)元凋亡,改善實(shí)驗(yàn)動物的神經(jīng)功能缺失、記憶障礙和腦萎縮等臨床癥狀。本研究結(jié)果說明了去鐵胺對疾病的干預(yù)作用。

研究顯示〔12〕炎癥性應(yīng)激是腦出血后繼發(fā)性腦損傷病理過程中的重要機(jī)制之一。腦出血發(fā)生后,血腫周圍組織血灌流量明顯下降,神經(jīng)元細(xì)胞處于缺氧缺血狀態(tài),腦組織開始炎癥性應(yīng)激,炎性反應(yīng)酶MPO大量表達(dá),刺激TNF-α和IL-1β大量釋放,導(dǎo)致神經(jīng)元活性降低,細(xì)胞異常凋亡。Zeng等〔13〕研究報道,在大鼠腦出血模型中抑制炎癥性應(yīng)激能明顯改善動物的腦水腫狀態(tài),改善其神經(jīng)功能。本研究結(jié)果證實(shí)了去鐵胺對炎癥性應(yīng)激的抑制作用。

海馬區(qū)神經(jīng)元活性、結(jié)構(gòu)的完整、突觸的有效傳遞是進(jìn)行認(rèn)知與記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)。β-Tubulin和MAP2是海馬區(qū)細(xì)胞骨架中維系微管穩(wěn)定的關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)蛋白,在神經(jīng)元細(xì)胞分化、損傷修復(fù)、突觸傳遞中發(fā)揮重要作用,GCN是海馬區(qū)中阻遏記憶儲存的重要因子,是抑制神經(jīng)突觸傳遞的重要蛋白〔14〕。本研究結(jié)果證實(shí)了去鐵胺改善動物記憶作用的靶點(diǎn)。