王文豪 張欣 孫振民 孫佳 趙成龍 李玉莉 高志星

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1臨床醫(yī)學(xué)院,山東 濰坊 261053;2整形外科研究所;3附屬醫(yī)院消化內(nèi)一科)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確的,特發(fā)性、慢性的結(jié)腸黏膜炎癥性疾病。具有復(fù)雜的遺傳背景,環(huán)境、心理、免疫,腸道微生態(tài)等多種因素共同作用。始于直腸,通常以連續(xù)的方式向近端延伸至部分或整個(gè)結(jié)腸,一些直腸炎或左側(cè)結(jié)腸炎患者可能有盲腸內(nèi)的炎性斑塊〔1〕。臨床進(jìn)程不可預(yù)測(cè),主要是因?yàn)榘l(fā)作期和緩解期交替出現(xiàn)。臨床上潰瘍性結(jié)腸炎患者通常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和便血〔2〕。其他多種疾病也與UC有關(guān),包括葡萄膜炎、硬膜炎、視神經(jīng)炎、骨質(zhì)疏松、牛皮癬、抑郁癥、sweet綜合征、口腔炎等。UC的年齡分布最有可能出現(xiàn)在生命的第2或第4個(gè)10年,沒有特定的性別偏好〔3〕。我國流行病學(xué)資料顯示我國大陸地區(qū)的UC發(fā)病率約為11.6/10 000,且尚有數(shù)據(jù)未被完全統(tǒng)計(jì),存在被低估的可能〔4～6〕。不難看出UC在我國仍屬少見病,但近20余年來其就診人數(shù)呈快速上升趨勢(shì)〔7〕。盡管涉及UC發(fā)病的病因仍不確定,但是各種動(dòng)物模型的研究為揭示UC的發(fā)病和進(jìn)展提供了新的見解。各種化學(xué)誘導(dǎo)型UC模型已在實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。這些模型緊密模仿人類UC的形態(tài),組織病理學(xué)及臨床癥狀特征。在化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中,最廣泛使用的是三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)的結(jié)腸炎和右旋糖酐硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型〔8〕。本研究對(duì)這兩種UC大鼠建模方式進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1材料 8周齡,體質(zhì)量180～220 g SPF級(jí)Wistar雄性大鼠18只,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(魯)20190003。根據(jù)濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的程序進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以減輕疼痛和避免傷害。實(shí)驗(yàn)方案均嚴(yán)格按照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指導(dǎo)建議》執(zhí)行。盡一切努力使動(dòng)物遭受的痛苦最小化。TNBS購自美國sigma,DSS購自美國MPBIO。

1.2分組 將18只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為TNBS/乙醇組、DSS組及健康對(duì)照組各6只。動(dòng)物飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流房?jī)?nèi),室溫(20±2)℃,相對(duì)濕度50%～60%,顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水。

1.3TNBS/乙醇法建立大鼠UC模型 根據(jù)Morris 等〔9〕研究,采用TNBS/乙醇法誘導(dǎo)UC模型。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,禁食、不禁水24 h,腹腔注射30 mg/ml戊巴比妥鈉,麻醉成功后,采取頭低腳高,將直徑約2 mm橡膠管,自肛門緩慢插入直腸約8 cm,灌入TNBS原液100 mg/kg+50%乙醇0.25 ml,取頭低尾高位,呈20～30 °角,持續(xù)30 s,放置籠中,建模結(jié)束,清醒后自由飲食。

1.4DSS溶液自由飲水法建立大鼠UC模型 根據(jù)Fichna等〔10〕研究,本實(shí)驗(yàn)采用4%DSS自由飲水法建立大鼠UC模型。適應(yīng)性給喂養(yǎng)1 w后用4%DSS代替飲用水,連續(xù)7 d自由飲用進(jìn)行誘導(dǎo),DSS溶液每2 d換1次,以保持溶液質(zhì)量,7 d后換回普通飲用水,建模結(jié)束。

1.5一般狀況的觀察 3組建模結(jié)束后觀察大鼠有無活動(dòng)減少、毛色異常,每日同一時(shí)間稱取各組大鼠體質(zhì)量,記錄其大便性狀及大便隱血或肉眼血便狀況并且收集糞便。大便隱血檢測(cè)運(yùn)用便隱血檢測(cè)試紙(聯(lián)苯胺法):挑取少許糞便于濾紙上,加1%聯(lián)苯胺冰醋酸溶液1～2滴,加3%過氧化氫溶液1～2滴。加試劑后2 min試紙反應(yīng)區(qū)不顯色為隱血試驗(yàn)陰性(-);加試劑10 s后,反應(yīng)區(qū)顯淺藍(lán)色,漸變藍(lán)色為隱血試驗(yàn)陽性(+);加入試劑后反應(yīng)區(qū)初顯淺藍(lán)褐色,漸加深變明顯褐色為隱血試驗(yàn)陽性();加入試劑后反應(yīng)區(qū)立即顯藍(lán)褐色為隱血試驗(yàn)陽性()。按表1進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)價(jià),DAI =(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6標(biāo)本采集及處理 3組大鼠建模結(jié)束1 w后,剖殺取材后當(dāng)天死亡,1只在建模結(jié)束后第2天死亡)。禁食不禁水24 h,過量30 mg/ml戊巴比妥鈉腹腔注射。迅速剖開大鼠腹腔,游離脾臟稱重,游離肛門至盲腸末端腸管,測(cè)量結(jié)直腸長度及重量,沿縱軸剖開,冰生理鹽水沖洗腸管內(nèi)表面,吸水紙拭干,平鋪于濾紙上,以觀察結(jié)腸組織大體形態(tài),取各組大鼠結(jié)腸相同部位組織,依次進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、攤片、烤片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片制作結(jié)腸病理組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,過碘酸雪夫(PAS)染色,將大鼠結(jié)腸中的黏液素染成紫紅色,光鏡下觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般狀況 建模后健康對(duì)照組體質(zhì)量一直呈上升趨勢(shì),糞便顆粒狀,糞便潛血陰性,無肉眼血便。TNBS/乙醇組建模后第1天出現(xiàn)肉眼血便,后血便明顯,體質(zhì)量不斷下降,糞便呈稀便。DSS組建模后第1天出現(xiàn)肉眼血便,第3天肉眼血便消失,糞便隱血強(qiáng)陽性,體質(zhì)量不斷下降,糞便不成形。TNBS/乙醇組和DSS組 DAI評(píng)分〔(2.4±0.43),(2.25±0.34)分〕明顯高于健康對(duì)照組〔(0.13±0.1)分,P<0.01〕。而TNBS/乙醇組和DSS組 DAI 評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TNBS/乙醇組大鼠1只在建模當(dāng)天死亡,1只在建模結(jié)束后第2天死亡,DSS組和健康對(duì)照組正常生存。3組生存曲線見圖1。

圖1 3組生存曲線

2.2結(jié)腸損傷評(píng)價(jià) TNBS/乙醇法建立的大鼠UC模型,受損腸壁堅(jiān)硬,彈性差,在結(jié)腸距離肛門約8 cm處可見肉眼巨大潰瘍面或腫塊,伴有糜爛,充血。DSS組剖開腸管并未發(fā)現(xiàn)肉眼可見潰瘍面,腸壁較柔軟,腸壁可見小的出血點(diǎn),健康對(duì)照組結(jié)腸表面未見明顯異常。見圖2。

圖2 各組結(jié)腸

2.3結(jié)腸組織病理學(xué) HE染色可見,健康對(duì)照組正常黏膜,黏膜下層,腸隱窩和肌肉層的微觀特征,結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整,無炎癥,隱窩完整,杯狀細(xì)胞豐富。TNBS/乙醇組結(jié)腸HE顯示炎性細(xì)胞浸潤黏膜及黏膜下層,甚至達(dá)肌層。有廣泛彌漫性炎性細(xì)胞浸潤,黏膜及黏膜下層可見糜爛和潰瘍,隱窩結(jié)構(gòu)改變,大小、形態(tài)不規(guī)則,腺體減少,可見隱窩膿腫等。DSS組固有膜內(nèi)有彌漫性炎性細(xì)胞潤,包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等,尤其是上皮細(xì)胞間有中性粒細(xì)胞浸潤(即隱窩炎)。隱窩結(jié)構(gòu)改變,隱窩大小、形態(tài)不規(guī)則,分支、出芽,排列紊亂,杯狀細(xì)胞減少等。PAS染色可見,健康對(duì)照組腸道腺體排列規(guī)整,呈管狀,可見大量染色陽性的含黏液杯狀細(xì)胞,腺腔表面亦可見染色陽性細(xì)胞。TNBS/乙醇組和DSS組黏液素較健康對(duì)照組明顯減少。TNBS/乙醇組和DSS組未見明顯差異。見圖3。

圖3 3組結(jié)腸組織病理學(xué)(×40)

3 討 論

TNBS/乙醇法誘導(dǎo)UC的過程中,乙醇起到破壞大鼠的腸壁黏膜屏障的作用,造成腸黏膜的損傷,TNBS作為半抗原能與賴氨酸的E-氨基共價(jià)結(jié)合,修飾細(xì)胞表面蛋白。引起 Th1 介導(dǎo)的免疫反應(yīng),表現(xiàn)為黏膜固有層 CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤增多,產(chǎn)生炎癥改變〔11,12〕。Grisham等〔13〕認(rèn)為,由于抗壞血酸鹽和TNBS之間的相互作用,TNBS可以(酶法和非酶法)代謝生成O2-和H2O2,提示TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎可能部分是由TNBS氧化代謝產(chǎn)生的細(xì)胞毒性活性氧代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的。TNBS/乙醇誘導(dǎo)的大鼠UC,大鼠同樣表現(xiàn)出腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕等與人類UC相似的臨床癥狀,方法簡(jiǎn)單,建模時(shí)間短暫,只需一次灌腸給藥,且建模成本相對(duì)較低,大鼠間差異相對(duì)較小。但對(duì)于結(jié)腸壁損傷較大,潰瘍面肉眼可見且出現(xiàn)假性息肉,甚至出現(xiàn)穿透性潰瘍,模型死亡率較高,且潰瘍面集中在距離肛門8 cm處,這與灌腸方法有著直接關(guān)系。因此該模型更適用于研究依賴于CD4+T 細(xì)胞免疫功能的腸道炎癥反應(yīng)。

DSS是一種具有抗凝作用的硫酸多醣,PerSe等〔14〕研究表明,DSS對(duì)結(jié)腸上皮屏障的完整性具有破壞性,可使腸黏膜通透性增加,導(dǎo)致多糖等大分子物質(zhì)更易滲入腸黏膜組織中,進(jìn)而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng),Okayasu等〔15,16〕發(fā)現(xiàn),DSS引起腸道菌群的改變,特別是革蘭陰性厭氧菌數(shù)量的增加,包括桿菌科,進(jìn)而導(dǎo)致腸道內(nèi)破壞和炎癥改變。DSS誘導(dǎo)UC大鼠表現(xiàn)出腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕等與人類UC相似的臨床癥狀,病理表現(xiàn)也與人類UC臨床相似,建模方式簡(jiǎn)單,成模率高,可重復(fù)性強(qiáng),但建模成本較高,且周期相對(duì)較長,自由飲水無法控制每只大鼠飲水量,建模后大鼠間差異較大。因此DSS 模型更適用于腸黏膜損傷、腸道菌群改變?cè)赨C發(fā)生發(fā)展中作用的研究。

綜上,TNBS/乙醇法建立的模型更適用于研究依賴于CD4+T 細(xì)胞免疫功能的腸道炎癥反應(yīng),而DSS 模型更適用于腸黏膜損傷、腸道菌群改變?cè)赨C發(fā)生發(fā)展中的作用研究。