易宇光 何佳佳 吳俊波

(萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院,江西 萍鄉(xiāng) 337000)

高血性腦出血(HICH)由于腦底小動(dòng)脈發(fā)生病理性變化,相應(yīng)動(dòng)脈血管管壁變薄,彈性變小并產(chǎn)生擴(kuò)張,當(dāng)情緒變化劇烈、過(guò)度勞累、不良的飲食習(xí)慣等引起血壓急劇升高直至腦部血管破裂,導(dǎo)致血栓素A2,組胺,緩激肽釋放,改變腦部血液流量分布〔1〕。核因子-E2相關(guān)因子(Nrf)2共分為6個(gè)功能區(qū),其中Neh4、Neh5 在轉(zhuǎn)錄激活劑作用下與抗氧化反應(yīng)原件(ARE)結(jié)合,參與啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)域〔2,3〕。Nrf2/ARE信號(hào)通路作為一種抗氧化防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)等方面扮演著重要角色〔4〕。miR-27b是 miR-27家族的一個(gè)亞型〔5〕,miR-27b具有響應(yīng)生物體氧化應(yīng)激反應(yīng)的功能,并參與Ⅱ型糖尿病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展〔6〕。有研究表明〔7〕,Nrf2是miR-27b直接靶基因,有特定的結(jié)合位點(diǎn),Nrf2和miR-27b均對(duì)HICH形成有一定的影響,均與抗細(xì)胞凋亡及調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)。本研究基于Nrf2/ARE信號(hào)通路探討抑制miR-27b對(duì)HICH大鼠模型神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 75只健康雄性無(wú)特定病原體大鼠(8～10周齡)購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國(guó)北京),在22～25 ℃的單獨(dú)通風(fēng)籠中飼養(yǎng)。

1.2HICH大鼠模型制備 采用6%水合氯醛 (400 mg/kg)對(duì)大鼠腹腔麻醉,沿腹中線切開(kāi)腹腔暴露雙側(cè)腎臟,用銀夾鉗夾雙側(cè)腎動(dòng)脈后縫合腹腔;在高血壓術(shù)后60 d,將大鼠俯臥位固定于定位儀上,正中矢狀切開(kāi)頭皮。顱骨背側(cè)鉆孔,微量進(jìn)樣器進(jìn)針尾狀核位置,斷尾取血,注入大鼠腦內(nèi)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 75只雄性HICH大鼠稱重并隨機(jī)均分為5組:①空白(SM)組:采用腦出血模型同樣的制備方法,但進(jìn)針后注射50 μl生理鹽水,大腦右側(cè)腦室注射5 μl生理鹽水;②對(duì)照(HICH)組:采用腦出血模型同樣的制備方法,并大腦右側(cè)腦室注射5 μl生理鹽水;③miR-27b陰性對(duì)照(HICH+AR)組:大腦右側(cè)腦室注射5 μl miR-27b拮抗劑陰性對(duì)照物(20 nmoL/L);④miR-27b抑制(HICH+ATR)組:5 μl miR-27b拮抗劑(20 nmoL/L)注入大鼠右側(cè)腦室;⑤miR-27b陽(yáng)性對(duì)照(HICH+TBHQ)組:大鼠右側(cè)腦室注射5 μl特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ,50 mg/L,Nrf2激動(dòng)劑)。所有大鼠都被正常喂養(yǎng),隨意飲水,交替12 h的明/暗周期。

1.4熒光素酶報(bào)告基因分析 含有miR-27b結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT)Nrf 2的3′-UTR和突變型(MUT)Nrf2的3′-UTR被擴(kuò)增并插入pmirGLO載體。WT和MUT的正確熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-27b agomir共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中,48 h收集細(xì)胞,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板換成新制備的培養(yǎng)基和熒光素酶底物,光度計(jì)測(cè)量每個(gè)孔中的熒光素酶活性。加終止緩沖液渦旋振蕩10 min后,測(cè)量每個(gè)孔中的熒光素酶活性。

1.5qRT-PCR試驗(yàn) 采用Trizol法提取HICH組紋狀體腦組織總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。分別在建模后的第6 h、12 h、24 h、48 h和72 h,采用qRT-PCR檢測(cè)HICH組和SM組miR-27b及Nrf2 mRNA水平,目的基因引物序列如下:miR-27b上游引物5′-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3′、下游5′-CGCAGCTACTCCAAGAATCCG-3′,Nrf2上游引物5′-TTTGT-AGATGACCATGAGTCGC-3′、下游5′-GCACATCTCA-GTGATCTCACCT-3′;GAPDH上游引物5′-CTCCG-ATCTTACGAACA-3′,下游5′-AATGCTAGACGCACTTGCGT-3′。用 cDNA模板對(duì)相關(guān)基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,miR-27b的mRNA 3′-5′端引物為試劑盒常用引物。采用2-ΔΔCt表示mRNA相對(duì)表達(dá)。

1.6Western印跡試驗(yàn) 取各組大鼠紋狀體腦組織,加入RIPA細(xì)胞裂解液,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白,聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜,加一抗〔B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、GAPDH,24 h〕,再加二抗(Bcl-2、Bax、GAPDH,2 h)。TBST洗膜后顯影成像,蛋白表達(dá)相對(duì)定量計(jì)算。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 分別從5組收集取大鼠紋狀體腦組織制備10%組織勻漿,試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β的水平。將40 μl組織勻漿加入到孔中,并在37 ℃孵育60 min,洗滌顯影。在37 ℃下再溫育10 min后,使用消除劑終止反應(yīng),測(cè)定每支試管中OD值(450 nm)。組織勻漿在4 ℃下離心5 min(3 000 r/min),制備細(xì)胞懸浮液,計(jì)算細(xì)胞總數(shù),進(jìn)行賴特染色。

1.8噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力 取各組細(xì)胞,接種至96孔板,于溫箱培養(yǎng)。加MTT溶液孵育4 h,加150 μl二甲基亞砜(DMSO),檢測(cè)波長(zhǎng)為OD=490 nm處的吸光度,計(jì)算細(xì)胞活力。

1.9流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期 收集各組細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化,離心后去掉上清,PBS洗2次,吸盡上清液加預(yù)冷乙醇溶液振蕩過(guò)夜。PBS洗1次,碘化丙啶染色20 min,儀器檢測(cè)細(xì)胞周期情況。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)操作前期步驟同上,取細(xì)胞離心并固定,按說(shuō)明書加入染色劑10 ml,置于4 ℃冰箱中孵育30 min,儀器測(cè)定結(jié)果并分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPAA21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1熒光素酶報(bào)告結(jié)果 研究通過(guò)靶向預(yù)測(cè)程序證實(shí)了Nrf2的3′-UTR和miR-27b序列之間存在特異性結(jié)合區(qū)。miR-27b和Nrf2之間的靶向關(guān)系通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析來(lái)驗(yàn)證。見(jiàn)圖1。miR-27b組WT3′-UTR熒光素酶活性被顯著抑制(P< 0.05),而MUT3′-UTR的熒光素酶活性沒(méi)有表現(xiàn)出類似的效果(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 熒光素酶報(bào)告結(jié)果

圖1 熒光素酶報(bào)告結(jié)果

2.2qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 HICH大鼠miR-27b和Nrf2 mRNA表達(dá)變化,與SM組相比,在HICH后6 h開(kāi)始miR-27b表達(dá)量顯著下降(P<0.05),24 h miR-27表達(dá)達(dá)到最低水平;Nrf2 mRNA表達(dá)量在HICH后6 h開(kāi)始顯著上升(P<0.05),在24 h達(dá)到最高水平(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miR-27b及Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果 與SM組相比,HICH+AR組、HICH組TNF-α、IL-1β及IL-6顯著升高,HICH+ATR組、HICH+TBHQ組TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)、IL-β、IL-6、TNF-α、細(xì)胞活力及凋亡比較

2.4MTT法檢測(cè)結(jié)果 與SM組比較,HICH組和HICH+AR組可以顯著降低神經(jīng)細(xì)胞活力,而HICH+TBHQ組和HICH+ATR組則會(huì)明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 與SM組比較,HICH組和HICH+AR組細(xì)胞凋亡率顯著增加,而HICH+TBHQ組和HICH+ATR組凋亡率顯著下降(均P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

圖2 流式細(xì)胞分析法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

2.6Western印跡檢測(cè)結(jié)果 與SM組相比,HICH+ATR組、HICH+TBHQ組Bax蛋白表達(dá)顯著降低,Bcl-2蛋白顯著升高,HICH+AR組、HICH組Bax蛋白表達(dá)顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

1～5:HICH+AR組、HICH+ATR組、HICH+TBHQ組、SM組、HICH組

3 討 論

近些年,HICH發(fā)病率逐年升高,外科手術(shù)方法對(duì)患者身體預(yù)后效果差,容易復(fù)發(fā),現(xiàn)有的治療藥物如他汀類藥物,內(nèi)皮素受體拮抗劑等不良反應(yīng)大,療效差〔8〕。Nrf2/ARE信號(hào)通路參與HICH疾病發(fā)生,尋找到調(diào)控此種信號(hào)通路的基因可作為開(kāi)發(fā)新藥物的靶點(diǎn)。miR-27b可直接調(diào)控Nrf2基因,且與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

HICH發(fā)病后產(chǎn)生繼發(fā)性損害腦水腫,血腫分解導(dǎo)致血細(xì)胞分解產(chǎn)生神經(jīng)毒性物質(zhì),使得炎癥細(xì)胞在病灶處聚集,產(chǎn)生大量炎癥因子,造成神經(jīng)細(xì)胞損害和凋亡〔9〕。HICH發(fā)病區(qū)域多位于尾狀核、殼核和丘腦,故實(shí)驗(yàn)所用腦組織材于尾狀核。HICH最嚴(yán)重的的病理反應(yīng)是神經(jīng)損害及炎癥反應(yīng),對(duì)兩種指標(biāo)即神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況及炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平進(jìn)行了測(cè)定。Nrf2/ARE信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、腫瘤的形成、衰老及細(xì)胞凋亡等多種生理疾病發(fā)生機(jī)制〔10〕,其中與HICH的形成密切相關(guān)的作用是抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡以及抑制炎癥因子的產(chǎn)生〔11,12〕。熒光素酶報(bào)告基因分析確定Nrf2是為miR-27b的直接靶基因〔13〕,靶向預(yù)測(cè)程序結(jié)果顯示兩者有特定的結(jié)合位點(diǎn),熒光素酶活性報(bào)告與qRT-PCR檢測(cè)顯示miR-27b可直接抑制Nrf2的表達(dá),從而阻礙Nrf2/ARE信號(hào)通路及其下游相關(guān)基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)〔14〕,紫檀芪可以通過(guò)激活 Nrf2 來(lái)上調(diào)Bcl-2,下調(diào)Bax,抑制胰腺 β 細(xì)胞的凋亡。為驗(yàn)證抑制miR-27b對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響,研究測(cè)定了各組大鼠與凋亡相關(guān)的調(diào)控基因Bax和Bcl-2 基因,miR-27b抑制組相比對(duì)照組Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào),Bax蛋白含量明顯降低,miR-27b抑制組相比對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞活力相比明顯升高,細(xì)胞凋亡數(shù)顯著下降〔15〕。抑制miR-27b可激活Nrf2/ARE信號(hào)通路,使得Bcl-2 蛋白過(guò)量表達(dá)并結(jié)合Bax,增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞活力,減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔16〕。有研究〔17〕顯示,對(duì)照組抑制Nrf2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-27b抑制組的HICH大鼠與Nrf2促進(jìn)劑的大鼠三者驗(yàn)證因子表達(dá)水平遠(yuǎn)小于HICH組,說(shuō)明抑制miR-27b的表達(dá),增加Nrf2的表達(dá)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路,抑制巨噬細(xì)胞活性,減少炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,從而減少炎癥因子的含量起到抗炎的作用。

近年Nrf2/ARE信號(hào)通路受到廣泛關(guān)注,未有研究發(fā)現(xiàn)HICH疾病的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)可通過(guò)miR-27b調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)通路來(lái)控制,本研究具有首創(chuàng)性。根據(jù)此次研究可以為研發(fā)治療HICH疾病的相關(guān)藥物提供新的思路和依據(jù)。但研究仍有局限性,如HICH大鼠模型的建立通過(guò)向腦部注射自體血液模擬腦出血,達(dá)到簡(jiǎn)單模擬與真實(shí)情況相差較大,此外炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6都是NF-κB的表達(dá)產(chǎn)物,可進(jìn)一步研究NF-κB與Nrf2/ARE信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)。

綜上,通過(guò)抑制miR-27b的表達(dá),增加Nrf2的表達(dá)使得Bcl-2 蛋白過(guò)表達(dá)并結(jié)合Bax蛋白實(shí)現(xiàn)了抑制HICH大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及減少HICH大鼠炎癥因子含量從而抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生。