陳敏暉,劉欣茹,黃秀瓊,林琴,毛雅珍*

染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)技術(shù)中的單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism,SNP array)技術(shù),能夠在全基因組水平進行掃描,不僅能檢出拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs),還能檢出大多數(shù)的單親二倍體、三倍體和低比例嵌合[1],CMA技術(shù)與傳統(tǒng)核型分析比較,具有高分辨率、高通量、周期短等優(yōu)點,在臨床應(yīng)用中能有效檢出17p12微缺失/重復(fù)。目前,17p12區(qū)域微缺失/重復(fù)的產(chǎn)前診斷病例很少,本研究報道6例17p12片段微缺失/重復(fù)胎兒產(chǎn)前診斷情況,并對微缺失/重復(fù)區(qū)域包含基因、變異來源及其致病性等進行討論,為復(fù)發(fā)性17p12區(qū)域[17p12 recurrent (HNPP/CMT1A) region (includes PMP22)]的微缺失/重復(fù)的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2021年12月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院接受介入性產(chǎn)前診斷、SNP array結(jié)果為17p12區(qū)域微缺失/重復(fù)的6例孕婦,對其產(chǎn)前診斷指征、胎兒超聲檢查情況、胎兒染色體核型、胎兒父母SNP array檢測結(jié)果、妊娠結(jié)局、出生后的情況進行分析,行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦在檢測前均充分知情并簽署知情同意書。本次研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 對符合產(chǎn)前診斷指征的孕婦,在妊娠18～25周,抽取羊水30 mL用于染色體核型分析和SNP array分析。

1.2.2 染色體核型分析 將上述采集的羊水離心后,貼壁細胞法培養(yǎng)獲得羊水細胞制片,G顯帶后對中期分裂相進行染色體核型分析。

1.2.3 SNP array 采用美國Affymetrix公司生產(chǎn)的CytoScan 750k芯片試劑盒(Affymetrix,USA)分析,將樣本DNA和高密度覆蓋SNP和CNV探針的基因芯片雜交,在全基因組水平進行檢測,檢索相同或相似區(qū)段的 CNV 研究的文獻,解讀該區(qū)域的CNV與疾病的相關(guān)性,根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)指南(ACMG)[2],通過查詢DECIPHER(https://www.deciphergenomics.org/)、DGV(http:// dgv.tcag.ca /dgv/)、OMIM(https://omim.org/)、Pubmed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)以及UCSC(http://genome.ucsc.edu/)等數(shù)據(jù)庫對CNVs的臨床意義進行分析。建議對臨床意義不明變異(variants of uncertain significance,VUS)的胎兒父母外周血樣本進行SNP array檢測,通過結(jié)合家系可判斷該CNVs的最終性質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 胎兒產(chǎn)前診斷指征及親代的溯源情況

6例17p12區(qū)域微缺失/重復(fù)孕婦的介入性產(chǎn)前診斷指征包括:胎兒產(chǎn)前超聲指標異常4例、孕婦高齡1例、孕婦高齡且胎兒產(chǎn)前超聲指標異常1例,所有病例染色體核型分析均未發(fā)現(xiàn)異常;4例微缺失的胎兒宮內(nèi)表型涉及心臟、鼻骨和頸項透明層等的超聲異常,其中2例17p12微缺失通過抽取父母外周血樣進行驗證,結(jié)果顯示,2例微缺失都遺傳自表型正常的父親,余2例拒絕進行家系驗證;2例微重復(fù)胎兒宮內(nèi)表型分別為腎多發(fā)囊性病變和四疊體池處囊腫,其中1例父母拒絕行家系驗證,另1例經(jīng)過家系驗證后發(fā)現(xiàn)屬于新發(fā)病例。見下頁表1。

2.2 SNP array檢測結(jié)果

4例17p12微缺失病例缺失的片段長度都為1.4 Mb,均包含PMP22、COX10、HS3ST3B1和TEKT3等4個OMIM基因,2例微重復(fù)病例重復(fù)的片段包含的OMIM基因與之一致。復(fù)發(fā)性17p12區(qū)域的基因型見圖1(彩插2)。

2.3 致病性分析

例1～4胎兒的17號染色體p12區(qū)域存在1.4 Mb的微缺失,而例5～6胎兒的17號染色體p12區(qū)域存在1.3 Mb的微重復(fù),包含PMP22基因的復(fù)發(fā)性17p12的CNV[17p12 recurrent (HNPP/CMT1A) region (includes PMP22)]。根據(jù)ACMG指南,ClinGen數(shù)據(jù)庫評議該區(qū)域和PMP22基因具有單倍劑量效應(yīng)(haploinfficiency score:3)。

2.4 妊娠結(jié)局及隨訪

除腎多發(fā)囊性病變和四疊體池處囊腫的例5和例6選擇放棄妊娠,例1～4選擇繼續(xù)妊娠,胎兒出生情況正常,分別于出生后24月、18月、33月和18月進行電話隨訪,除例4仍存在輕度的三尖瓣流反流外,其余發(fā)育情況均未見異常。見下頁表1。

表1 6例17p12微缺失/重復(fù)胎兒的SNParray檢測結(jié)果和臨床分析

3 討論

羊水染色體核型分析技術(shù)是產(chǎn)前診斷細胞遺傳學(xué)的“金標準”,它能夠檢測染色體的數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常,由于該方法僅在亞顯微水平,并受限于制片、顯帶水平的差異,只能檢測大于5～10 Mb結(jié)構(gòu)異常[3]。由于本研究6例17p12的CNV片段的變異僅有1.3～1.4 Mb,故其染色體核型分析的檢測結(jié)果均正常。CMA技術(shù)能夠檢測出常規(guī)染色體核型分析不能發(fā)現(xiàn)的染色體微缺失和微重復(fù),從而大大提高了染色體結(jié)構(gòu)異常的檢出率。因此在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域,該技術(shù)被推薦為產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒存在結(jié)構(gòu)異常的一線檢測方法[4]。

關(guān)于復(fù)發(fā)性17p12區(qū)域的微缺失/重復(fù)的產(chǎn)前診斷報道很少,本研究6例胎兒因涉及心臟、大腦、腎臟等系統(tǒng)的超聲異常及孕婦高齡,行介入性產(chǎn)前診斷后發(fā)現(xiàn)17p12區(qū)域的CNV異常,該片段的微重復(fù)/缺失均包含PMP22、COX10、HS3ST3B1和TEKT3等4個OMIM基因。檢索ClinGen數(shù)據(jù)庫可知,PMP22具有明確的單倍劑量不足效應(yīng),COX10基因無劑量效應(yīng),而HS3ST3B1和TEKT3是否具有劑量效應(yīng)還未知。

3.1 PMP22及17p12區(qū)域微缺失

外周髓磷脂蛋白-22 (PMP22)是結(jié)間髓鞘的完整膜糖蛋白,約占周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘蛋白總量的2%～5%[5]。PMP22在Schwann 細胞中高表達,促使其髓鞘形成并在調(diào)控Schwann 細胞增殖、分化及凋亡[6]。ClinGen數(shù)據(jù)庫評議PMP22基因具有單倍劑量效應(yīng),這提示PMP22為常染色體隱性基因,當一條17號染色體的17p12區(qū)域出現(xiàn)微缺失時,另一條17號染色體上的PMP22基因同時發(fā)生微缺失或發(fā)生了致病性單核苷酸變異的個體PMP22基因功能將被破壞。基因組的劑量是保持平衡的,但有一些基因劑量敏感而引起基因組平衡的異常改變,稱之為劑量敏感基因。 當攜帶了劑量敏感基因的片段出現(xiàn)缺失或重復(fù)時,由于基因劑量減少而無法維持正常的生物學(xué)功能或是基因劑量的疊加而使該基因的功能被破壞,就可將其視作疾病[7]。已有研究報道PMP22基因突變或者累及PMP22等基因的17p12區(qū)段的缺失與常染色體顯性遺傳的遺傳性壓力易感性神經(jīng)病(hereditary neuropathy with liability to pressure palsies,HNPP)相關(guān)[8]。Hu等[9]在遺傳性神經(jīng)病小鼠模型(PMP22+/-)中觀察到伴有PMP22基因雜合缺失的小鼠模型髓鞘連接斷裂,導(dǎo)致壓力性麻痹。HNPP的特點是在青春期或青年期開始的個別神經(jīng)中反復(fù)出現(xiàn)感覺和運動神經(jīng)病變,神經(jīng)傳導(dǎo)檢測發(fā)現(xiàn)在卡壓部位存在局灶性傳導(dǎo)異常,以及神經(jīng)活檢發(fā)現(xiàn)髓鞘有香腸樣腫脹(小泡)[8]。由于臨床和電生理表現(xiàn)的異質(zhì)性,HNPP可能經(jīng)常被漏診或誤診,但HNPP患者預(yù)后一般良好[10-11]。

3.2 PMP22及17p12區(qū)域微重復(fù)

另有研究報道累及PMP22基因的17p12區(qū)段的重復(fù)與常染色體顯性遺傳的腓骨肌萎縮癥1A型(Charcot-Marie-Tooth type 1A,CMT1A)疾病相關(guān),該病典型的臨床表現(xiàn)為肢體遠端無力,感覺、腱反射減弱或消失以及足部畸形,雙膝關(guān)節(jié)以下明顯肌萎縮,呈“仙鶴腿”。但由于沒有嚴格的基因型-表型相關(guān)性,此病發(fā)病年齡和嚴重程度個體差異較大,臨床上可能表現(xiàn)出外顯不完全和表現(xiàn)度差異[12-13]。癥狀輕微者可僅有感覺不適甚至無癥狀,而嚴重者可導(dǎo)致癱瘓或殘疾。目前尚無針對CMT 的有效藥物,臨床僅采用對癥治療。

HNPP和CMT1A這兩類疾病都導(dǎo)致神經(jīng)病變,目前針對PMP22 的基因缺失、重復(fù)及其導(dǎo)致的HNPP和CMT1A尚無特效治療方法,臨床中也沒有治愈的直接方法和有效手段。根據(jù)CNVs檢測在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用指南[14],在檢測中發(fā)現(xiàn)一些成人期遲發(fā)性疾病,提示父母之一可能罹患同一疾病但尚未表現(xiàn)出臨床癥狀。

3.3 小結(jié)

本研究6例產(chǎn)前診斷17p12微缺失/重復(fù),其中3例選擇家系驗證,明確來自正常表型父親的例1和例2的孕婦及家屬選擇繼續(xù)妊娠,出生后近期隨訪未見異常,例3、4雖拒絕家系驗證,但孕婦及家屬充分考慮這個區(qū)域?qū)е翲NPP的臨床表型輕、預(yù)后良好、青春期后發(fā)病等的情況后也選擇繼續(xù)妊娠,例5和例6因胎兒超聲多發(fā)異常選擇放棄妊娠。

由于HNPP和CMT都是高度異質(zhì)性的神經(jīng)疾病,HNPP在青少年期發(fā)病,對癥治療的預(yù)后較好,而早發(fā)型的CMT在兒童期發(fā)病,癥狀嚴重、預(yù)后差,產(chǎn)前診斷過程中復(fù)發(fā)性17p12微重復(fù)致病的發(fā)現(xiàn),為孕婦及其家屬預(yù)防患病胎兒的出生提供了必要依據(jù),通過早干預(yù),盡快、盡早的康復(fù)訓(xùn)練可積極改善預(yù)后,避免嚴重臨床后遺癥的產(chǎn)生。

本研究的局限性:17p12區(qū)域和PMP22基因具有單倍劑量不足效應(yīng),但本研究納入的例1～4雖為微缺失的病例,其產(chǎn)前超聲僅發(fā)現(xiàn)一些軟指標異常,反而是例5～6為微重復(fù)的病例存在腎多發(fā)囊性病變等明顯結(jié)構(gòu)異常,可能的原因是病例1～4的軟指標異常和17p12區(qū)域的微缺失并不相關(guān),需要更多的17p12微缺失的產(chǎn)前診斷病例來說明胎兒在宮內(nèi)的表型;而17p12微重復(fù)的產(chǎn)前診斷病例未見到相關(guān)腎多發(fā)囊性病變等明顯結(jié)構(gòu)異常的報道,有可能是胎兒其他單基因產(chǎn)前17p12區(qū)域微缺失/重復(fù)的研究較少,后續(xù)將繼續(xù)進行相關(guān)數(shù)據(jù)的積累和研究,為其遺傳咨詢提供更多依據(jù)。