胡旭華 謝德隆

（上海天慈生物谷生物工程有限公司 上海 201315）

小兒清熱止咳口服液收錄于2020 版《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》），由麻黃、苦杏仁、石膏、黃芩、板藍根、甘草、北豆根七味藥配制蜂蜜蔗糖等輔料制成，用于小兒外感風(fēng)寒所致的感冒。方中麻黃辛甘溫，溫肺解表而平喘；石膏辛甘大寒，清泄肺胃之熱以生津，兩藥相輔相成，既能宣肺，又能清熱，共為君藥。杏仁味苦，降利肺氣而平喘咳，與麻黃相配則宣降相因，與石膏相伍則清肅協(xié)同，是為臣藥。再以苦寒之黃芩清肺瀉火解毒，板藍根、北豆根清熱解毒利咽。全方配伍則寒熱除，腫痛消，共奏清熱，宣肺，平喘，利咽之功。該方是在出自《傷寒論》的麻杏石甘湯基礎(chǔ)上增加了黃芩、板藍根、北豆根三味藥[1]。麻杏石甘湯是抗病毒性感冒的常用制劑[2]，小兒清熱止咳口服液在該方基礎(chǔ)上加以改進，增強了抗病毒、止咳、抗炎和平喘的療效[3]。

兒童病毒性肺炎容易對呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起損傷，是多病毒引起的兒科常見病，臨床治療以對癥和支持治療為主。兒童是傳染病的易感和高發(fā)人群，身體各項機能尚不完善，若不能及時診斷和治療，易出現(xiàn)各種并發(fā)癥，危害身體健康[4]。此外兒童用藥與成年人不同，不宜使用有明顯毒副作用的藥物，而小兒清熱止咳口服液已有多年臨床使用經(jīng)驗，毒副作用較小。本文在已知其抗病毒作用基礎(chǔ)上，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等工具進行理論推導(dǎo)以期通過理論活性成分為基礎(chǔ)探索其抗病毒性肺炎的作用及機制，為研制出適用于兒童的藥物提供理論依據(jù)。

1 工具與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和工具

數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP,http://tcmspw.com/index.php）；中藥分子機制生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫；DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank,PDB）。

工具：Cytoscape 3.6.0；SwissDock 分子對接在線平臺；PyMol 軟件。

1.2 小兒清熱止咳口服液有效成分篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中搜索小兒清熱止咳口服液6 味藥（不含石膏）的所有化學(xué)成分，以吸收、分布、代謝、排泄（absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME）參數(shù)中的口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%和類藥性（drug-like,DL）≥0.18 為篩選條件，得到每味藥的活性成分。為避免個別認可度較高的活性成分被篩選掉，故同時查閱《中國藥典》（2020 年版）與中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中相關(guān)文獻，得到此類成分并合并至上述篩選結(jié)果中，并從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載這些活性成分的靶點信息。

1.3 靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

應(yīng)用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫檢索得到肺炎相關(guān)靶點，將成分和疾病靶點取交集后得到小兒清熱止咳口服液抗病毒的關(guān)鍵靶點。再將“方劑-藥材-化合物-靶點-疾病”的藥理網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件，構(gòu)建小兒清熱止咳口服液的藥理網(wǎng)絡(luò)和蛋白相互作用（proteinprotein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用該軟件中“Network Analyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)度值（degree）篩選小兒清熱止咳口服液抗病毒的重要成分和關(guān)鍵靶點。

1.4 關(guān)鍵靶點功能富集分析

對篩選所得重要靶點應(yīng)用STRING 平臺KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，獲知小兒清熱止咳口服液產(chǎn)生抗病毒感染、肺部損傷作用的相關(guān)信號通路，分析其作用機制。

1.5 分子對接驗證

應(yīng)用SwissDock 在線分子對接軟件預(yù)測目標蛋白和小分子之間可能發(fā)生的分子相互作用。根據(jù)“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中重要的成分和PPI 網(wǎng)絡(luò)中的靶蛋白，以評價成分與靶點之間的對接效果。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物及疾病靶點篩選結(jié)果

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索，符合條件的化合物共有220 個，從這些活性成分獲得262 個作用靶點。在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中篩選疾病對應(yīng)的靶點，獲得疾病相關(guān)靶點621 個，與成分的靶點取交集得到62 個關(guān)鍵靶點。

2.2 構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)、靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)和PPI

靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析：將220 個成分與62 個靶點在Cytoscape 3.6.0 軟件中構(gòu)建小兒清熱止咳口服液成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（圖1，其中活性成分以橙色方形標示，關(guān)鍵靶點以藍色方形標示），共涉及146 個節(jié)點和440 條邊。采用度值評價，篩選10 個抗病毒的關(guān)鍵成分：山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩苷、芒柄花黃素、刺槐素、麻黃堿、甘草黃酮、異鼠李素和青藤堿。

圖1 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape 3.6.0 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），并利用MCODE 插件分解關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)（圖3），3 個連接緊密的子模塊被識別，其中1 個6-核子模塊為與炎癥相關(guān)蛋白間相互作用；2 個4-核子模塊為與抗病毒作用相關(guān)蛋白間相互作用、與細胞分裂作用相關(guān)蛋白之間的相互作用。

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)中的3個連接緊密的子模塊

2.3 關(guān)鍵靶點干預(yù)疾病過程富集分析

將62 個靶點輸入STRING 功能富集分析，設(shè)定統(tǒng)計指標為錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate,FDR）＜1×10－6，在KEGG 通路富集的結(jié)果中限定人類疾?。╤uman diseases）部分的通路，得到55 個靶標富集的疾病通路，其中12 個通路與病毒感染、肺部損傷相關(guān)（表1）。

表1 關(guān)鍵靶點KEGG通路富集分析

2.4 分子對接驗證

選擇小兒清熱止咳口服液中的麻黃堿和黃芩素，與PPI 網(wǎng)絡(luò)中抗病毒重要靶點RelA、MAPK14、IL-1B 進行分子對接驗證。在PDB 數(shù)據(jù)庫下載靶點晶體結(jié)構(gòu)文件，用PyMol 軟件移去水分子和配體分子，在Swiss Dock 在線軟件分別上傳靶蛋白和麻黃堿以及黃芩素的結(jié)構(gòu)文件。分子對接結(jié)果如表2 所示，蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合越緊密，full f itness 值越低，表明2 個成分與RelA、MAPK14、IL-1B 都可對接且對接效果較好。

表2 分子對接結(jié)果

3 討論

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)工具，分析“小兒清熱止咳口服液”組方成分抗病毒性肺炎的作用機制?；谘芯繉ο?、研究思路和工具，本研究屬于中西醫(yī)結(jié)合研究。為了更好地說明問題，本研究假設(shè)文中所列成分均在血液中發(fā)現(xiàn)[5-6]。

近年來，越來越多的研究關(guān)注于血清藥物化學(xué)/藥理學(xué)。其基本思想是，中藥一般經(jīng)口服用后在體內(nèi)會經(jīng)過吸收、分布、代謝等過程，可能形成含有中藥的原型成分、代謝產(chǎn)物及機體藥物作用下產(chǎn)生的新的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)的成分群，通過血液運輸?shù)礁鱾€器官組織或靶點，并在達到一定的血藥濃度時才能發(fā)揮藥效。因此研究血清藥物化學(xué)/藥理學(xué)才能真正揭示中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。但當(dāng)前，針對單味藥或復(fù)方的血清藥物化學(xué)/藥理學(xué)還比較少，且很多研究未更深入闡釋。比如董宇等[7]的益胃飲中藥血清藥物化學(xué)研究及鄧哲等[8]研究下瘀血湯的血清物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理學(xué)，均揭示了復(fù)方中的化學(xué)成分，但是缺乏與藥效或藥代動力學(xué)的結(jié)合，特別是能發(fā)現(xiàn)與藥效至關(guān)重要的成分及其相互關(guān)系。未來的研究應(yīng)著重研究復(fù)方的化學(xué)成分本質(zhì)，去偽存真，為創(chuàng)造更好的藥物提供思路或原型。

針對本復(fù)方的君藥和臣藥——麻黃和苦杏仁（石膏成分簡單），當(dāng)前采用血清藥物化學(xué)/藥理學(xué)方法研究上述藥物及相關(guān)復(fù)方的文獻較少。具有代表性的僅有唐鋒等[6]研究麻黃附子細辛湯的血清物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理學(xué)。因此可參考的實驗資料較少，同時這也是該領(lǐng)域今后的重要工作之一。

此外，我們并不假定所有成分均達到發(fā)揮生物效應(yīng)的濃度，因為中藥復(fù)方是一個整體。劉德麟等[9]提出了藥效分子群和藥效分子組合的概念，這可能比以化學(xué)單體來理解中藥更符合實際。

病毒性肺炎是病毒下蔓延，侵入肺后產(chǎn)生炎癥，屬于肺功能障礙的疾病[10]。臨床以利巴韋林等抗病毒藥物治療本病，但療效不佳、不良反應(yīng)較多。清熱解毒類中醫(yī)方劑對本病有顯著療效。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，小兒清熱止咳口服液抗病毒的關(guān)鍵成分：山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩苷、芒柄花黃素等；KEGG 通路分析結(jié)果中以IL-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等通路較為靠前，這些作用靶點與病毒感染、肺部損傷等密切相關(guān)。IL 是參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)的物質(zhì)，史東林等[11]用ELISA 檢測肺部感染患者感染前后IL 水平，發(fā)現(xiàn)感染后IL-17 等水平明顯上升。MAPK[12]是細胞質(zhì)中高度保守的絲氨酸蛋白激酶，在許多細胞因子的信號傳遞中起著重要的中介作用，其中p38 是調(diào)節(jié)細胞因子如IL-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）表達的重要細胞內(nèi)信號通路，參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，作為小兒清熱止咳口服液的重要通路，說明該處方通過抗炎和阻止病毒侵犯上皮細胞，起到抗病毒性肺炎的作用。

RelA 是一種抗病毒轉(zhuǎn)錄因子。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor,NF-κB）參與多種疾病的發(fā)病過程由5 個成員組成：p50、p52、p65（RelA）、c-Rel 和RelB，它們分別表達為相應(yīng)的蛋白質(zhì)NF-κB1、NF-κB2、RelA、Rel 和RelB，活化后與基因啟動子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄。有數(shù)量驚人的信號能夠激活NF-κB，它們包括細菌、病毒和真菌的產(chǎn)物以及炎癥細胞因子、氧化壓力和治療用的藥物。Bais 等[13]人闡明了依賴RelA 的生存因子，抑制了感染引起的細胞死亡，阻止了RELA 缺陷細胞中Chandipura 病毒的增殖。

《中國藥典》（2020 年版）中收載的小兒清熱止咳口服液以出膏率、麻黃堿含量、黃芩苷含量為指標，黃芩苷是該制劑發(fā)揮抗病毒作用的重要成分，以其含量為指標，保證其發(fā)揮抗病毒的療效。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過整合數(shù)據(jù)庫內(nèi)信息，挖掘出小兒清熱止咳口服液對病毒性肺炎潛在的治療作用，為拓寬其臨床使用范圍提供理論依據(jù)。