唐明花 劉璐
(1.上海利康瑞生物工程有限公司 上海 201707;2.上海昊海生物科技股份有限公司 上海 201613)
臨床手術(shù)中,難以縫合或縫合后滲血等問題給手術(shù)的進(jìn)行或者術(shù)后患者的恢復(fù)造成不小的困擾,選擇合適的醫(yī)用粘合劑是簡便有效的解決辦法。纖維蛋白粘合劑是一種天然粘合劑,因其具有良好的生物相容性,安全且不產(chǎn)生溶血等,在骨科、肝外科、腦/神經(jīng)外科、乳腺外科和胰腺手術(shù)等臨床中均有廣泛應(yīng)用。纖維蛋白粘合劑通過與自身機(jī)體的凝血系統(tǒng)的相互作用而產(chǎn)生預(yù)期凝血效果,同時(shí)亦能粘附在創(chuàng)面,發(fā)揮物理止血。枸櫞酸鈉作為豬纖維蛋白原中一種重要輔料,根據(jù)相關(guān)要求須控制其中的輔料量,所以找到適合本產(chǎn)品中枸櫞酸離子含量測定的方法尤為重要[1-3]。
枸櫞酸離子測定法收錄在中國藥典2020 版四部通則3108 中,其包含第一法比色法,第二法高效液相色譜法(一),第三法高效液相色譜法(二)[4]。
本產(chǎn)品枸櫞酸離子含量測定選用的是第一法比色法。按照此方法進(jìn)行檢樣的過程中,發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差,藥典給出的線性濃度范圍不適合本產(chǎn)品,蛋白沉淀方式不合理等一系列問題,且試驗(yàn)現(xiàn)象,如反應(yīng)后體系顏色等存在不確定性。所以本研究對供試品的處理方式,乙酸酐與吡啶體積比等進(jìn)行了一系列的改進(jìn),并經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證[5-7]。
豬纖維蛋白原(公司自制,批號(hào):S20181201、S20181215、S20190322);枸櫞酸鈉對照品(中國食品藥品檢定研究院);其他試劑均為市售分析純。
1)對照品溶液 精密稱量經(jīng)減壓干燥至恒重的枸櫞酸鈉0.53 g,置100 mL 量瓶中,加純化水溶解并稀釋至刻度,搖勻;精密量取5 mL,置50 mL 量瓶中,用5%三氯乙酸溶液稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液。
2)供試品溶液 取1 瓶豬纖維蛋白原,精密加入純化水2.5 mL,放置37 ℃水浴中至豬纖維蛋白原溶解,3瓶混勻;精密量取上述溶液1 mL 與純化水2 mL,混勻,以8 000 r/min 離心處理10 min;精密量取上清液0.5 mL與純化水4.5 mL,加入10%三氯乙酸溶液5 mL,混勻置60 ℃水浴中加熱5 min,以8 000 r/min 離心10 min,取上清液備用,即為供試品溶液。
3)專屬性溶液 5%三氯乙酸溶液,取5 g 三氯乙酸,加純化水100 mL 進(jìn)行溶解,混勻即得。
4)準(zhǔn)確度溶液 取精密稱定經(jīng)減壓干燥至恒重的枸櫞酸鈉0.40 g,置25 mL 容量瓶中,加純化水溶解后定容至刻度,混勻待用,記為準(zhǔn)確度溶液1。精密量取0.4、1.0、1.2 mL 準(zhǔn)確度溶液1 置不同具塞試管中,再各精密加入主體膠溶液1 mL,分別加入純化水4.6、4.0、3.8 mL,混勻后8 000 r/min 離心10 min;精密量取各上清液0.5 mL 與純化水4.5 mL,加10%三氯乙酸溶液5 mL,混勻,置60 ℃水浴加熱5 min,以8 000 r/min離心10 min,取二次上清液備用,每組準(zhǔn)確度測定溶液平行配制3 份(溶液1、溶液2、溶液3)。
精密吸取對照品溶液,配制成0.372、0.558、0.744、0.930、1.116 mmol/L 的線性溶液,吸取上述線性溶液各1 mL 置不同具塞試管中,各精密加吡啶1.3 mL,混勻,再精密加入醋酸酐5.1 mL,立即混勻并置(31±1)℃的水浴中,準(zhǔn)確放置35 min 后,按紫外-可見分光光度計(jì)法,在波長425 nm 處測定吸光度。以線性溶液的枸櫞酸離子濃度(mmol/L)對其相應(yīng)的吸光度值作直線回歸,求得直線回歸方程。
本方法對反應(yīng)溫度有嚴(yán)格要求,反應(yīng)液于室溫放置會(huì)導(dǎo)致澄清度降低、黃色加深,從而影響吸光度測定的準(zhǔn)確性。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),將反應(yīng)液置于冰浴可較好地避免這些問題的發(fā)生(圖1)。
圖1 不同溫度對反應(yīng)液顏色變化的影響
配制一定濃度的枸櫞酸鈉溶液(溶液1、2),按照中國藥典方法中乙酸酐與吡啶體積為5.7∶1.3 mL 時(shí),測得的含量結(jié)果與配制濃度的比值結(jié)果不理想。當(dāng)體積比(mL)為5.1∶1.3、5.7∶1.5 時(shí),檢測所得含量值與配制濃度的比值近似于100%,結(jié)果較好(表1)??紤]為減少易制毒試劑乙酸酐的使用量,故改進(jìn)后方法選用乙酸酐和吡啶體積分別為5.1 mL 和1.3 mL。
表1 乙酸酐和吡啶體積比對枸櫞酸離子含量測定的影響
取專屬性溶液上樣測定,測得吸光度值分別為0.000 0、0.000 1,結(jié)果顯示該溶液對枸櫞酸離子含量測定不產(chǎn)生干擾。
將配制的線性溶液上樣測定,獲直線回歸方程為y=0.394 7x+0.055 5,相關(guān)系數(shù)r為0.997 9,該方法可測定含量范圍為22.32~66.96 mmol/L。
取準(zhǔn)確度溶液1 mL 上樣測定,計(jì)算求得回收率。結(jié)果顯示3 組不同濃度的平均回收率(n=3)分別為100.6%、101.0%、98.79%,9 組準(zhǔn)確度溶液的回收率測得結(jié)果的平均值為100.1%(n=9),RSD 為1.48%(n=9)(表2),表明用所建立方法測得的含量值與加入量相比,基本接近,方法準(zhǔn)確度較好。
表2 回收率試驗(yàn)
在不同的日期,由兩位實(shí)驗(yàn)員分別平行制備6 份供試品溶液,測定吸光度,并計(jì)算枸櫞酸離子含量。結(jié)果顯示兩位實(shí)驗(yàn)員測得12 份樣品中枸櫞酸離子含量的平均值為29.94 mmol/L,RSD 為1.57%(n=12),結(jié)果滿足自定接受標(biāo)準(zhǔn)(RSD ≤5.0%)(表3)。
表3 精密度(重復(fù)性/中間精密度)
對照品溶液于2~8 ℃放置72 h、樣品溶液于室溫放置1 h 時(shí)所測得的枸櫞酸離子含量與0 時(shí)間點(diǎn)測得的含量的比值均在95.0%~105.0%之間,表明樣品和對照品穩(wěn)定性良好(表4)。
表4 溶液穩(wěn)定性
對蛋白沉淀溫度、反應(yīng)水浴溫度及最大吸收波長稍作改變,考察本方法的耐用性,結(jié)果顯示各參數(shù)改變后測得的枸櫞酸離子含量與中國藥典規(guī)定條件下測得的比值均在95.0%~105.0%,滿足自定標(biāo)準(zhǔn)(95.0%~105.0%),說明該方法耐用性良好(表5)。
表5 耐用性結(jié)果
取3 批豬纖維蛋白原進(jìn)行檢測,其枸櫞酸離子含量分別為29.61、29.58 和30.30 mmol/L,均符合纖維蛋白原枸櫞酸離子含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(不大于60 mmol/L),說明該方法的穩(wěn)定性好,檢測數(shù)值偏差較小。
中國藥典中對反應(yīng)結(jié)束后的溶液放置條件沒有明確,造成實(shí)際應(yīng)用中會(huì)出現(xiàn)待測溶液褪色現(xiàn)象,其吸光度值出現(xiàn)較大變化等問題,且該變化存在不確定性,造成測定結(jié)果的重現(xiàn)性差。通過研究,明確放置條件,大大提高了樣品的吸光度值的穩(wěn)定性。
該方法的檢測數(shù)據(jù)專屬性強(qiáng),線性和范圍、準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果良好,在后續(xù)產(chǎn)品檢測中重現(xiàn)性良好,可以作為豬纖維蛋白原中枸櫞酸離子含量的測定方法。本方法亦順利通過中國食品藥品檢定研究院的方法復(fù)核。
因本方法的反應(yīng)試劑用到了易制毒試劑乙酸酐,購買流程比較繁瑣;且本方法的時(shí)間性很強(qiáng),需要嚴(yán)格控制反應(yīng)試劑的加入量,對檢驗(yàn)人員操作熟練度要求也較高。所以下一步的研究將尋找一種更為簡便的方法。