唐明花 劉璐

（1.上海利康瑞生物工程有限公司 上海 201707；2.上海昊海生物科技股份有限公司 上海 201613）

臨床手術(shù)中，難以縫合或縫合后滲血等問題給手術(shù)的進(jìn)行或者術(shù)后患者的恢復(fù)造成不小的困擾，選擇合適的醫(yī)用粘合劑是簡便有效的解決辦法。纖維蛋白粘合劑是一種天然粘合劑，因其具有良好的生物相容性，安全且不產(chǎn)生溶血等，在骨科、肝外科、腦/神經(jīng)外科、乳腺外科和胰腺手術(shù)等臨床中均有廣泛應(yīng)用。纖維蛋白粘合劑通過與自身機(jī)體的凝血系統(tǒng)的相互作用而產(chǎn)生預(yù)期凝血效果，同時(shí)亦能粘附在創(chuàng)面，發(fā)揮物理止血。枸櫞酸鈉作為豬纖維蛋白原中一種重要輔料，根據(jù)相關(guān)要求須控制其中的輔料量，所以找到適合本產(chǎn)品中枸櫞酸離子含量測定的方法尤為重要[1-3]。

枸櫞酸離子測定法收錄在中國藥典2020 版四部通則3108 中，其包含第一法比色法，第二法高效液相色譜法（一），第三法高效液相色譜法（二）[4]。

本產(chǎn)品枸櫞酸離子含量測定選用的是第一法比色法。按照此方法進(jìn)行檢樣的過程中，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，藥典給出的線性濃度范圍不適合本產(chǎn)品，蛋白沉淀方式不合理等一系列問題，且試驗(yàn)現(xiàn)象，如反應(yīng)后體系顏色等存在不確定性。所以本研究對供試品的處理方式，乙酸酐與吡啶體積比等進(jìn)行了一系列的改進(jìn)，并經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證[5-7]。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬纖維蛋白原（公司自制，批號(hào)：S20181201、S20181215、S20190322）；枸櫞酸鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 溶液配制

1）對照品溶液 精密稱量經(jīng)減壓干燥至恒重的枸櫞酸鈉0.53 g，置100 mL 量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL 量瓶中，用5%三氯乙酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2）供試品溶液 取1 瓶豬纖維蛋白原，精密加入純化水2.5 mL，放置37 ℃水浴中至豬纖維蛋白原溶解，3瓶混勻；精密量取上述溶液1 mL 與純化水2 mL，混勻，以8 000 r/min 離心處理10 min；精密量取上清液0.5 mL與純化水4.5 mL，加入10%三氯乙酸溶液5 mL，混勻置60 ℃水浴中加熱5 min，以8 000 r/min 離心10 min，取上清液備用，即為供試品溶液。

3）專屬性溶液 5%三氯乙酸溶液，取5 g 三氯乙酸，加純化水100 mL 進(jìn)行溶解，混勻即得。

4）準(zhǔn)確度溶液 取精密稱定經(jīng)減壓干燥至恒重的枸櫞酸鈉0.40 g，置25 mL 容量瓶中，加純化水溶解后定容至刻度，混勻待用，記為準(zhǔn)確度溶液1。精密量取0.4、1.0、1.2 mL 準(zhǔn)確度溶液1 置不同具塞試管中，再各精密加入主體膠溶液1 mL，分別加入純化水4.6、4.0、3.8 mL，混勻后8 000 r/min 離心10 min；精密量取各上清液0.5 mL 與純化水4.5 mL，加10%三氯乙酸溶液5 mL，混勻，置60 ℃水浴加熱5 min，以8 000 r/min離心10 min，取二次上清液備用，每組準(zhǔn)確度測定溶液平行配制3 份（溶液1、溶液2、溶液3）。

1.3 測定方法

精密吸取對照品溶液，配制成0.372、0.558、0.744、0.930、1.116 mmol/L 的線性溶液，吸取上述線性溶液各1 mL 置不同具塞試管中，各精密加吡啶1.3 mL，混勻，再精密加入醋酸酐5.1 mL，立即混勻并置（31±1）℃的水浴中，準(zhǔn)確放置35 min 后，按紫外-可見分光光度計(jì)法，在波長425 nm 處測定吸光度。以線性溶液的枸櫞酸離子濃度（mmol/L）對其相應(yīng)的吸光度值作直線回歸，求得直線回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 冰浴效果考察

本方法對反應(yīng)溫度有嚴(yán)格要求，反應(yīng)液于室溫放置會(huì)導(dǎo)致澄清度降低、黃色加深，從而影響吸光度測定的準(zhǔn)確性。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，將反應(yīng)液置于冰浴可較好地避免這些問題的發(fā)生（圖1）。

圖1 不同溫度對反應(yīng)液顏色變化的影響

2.2 乙酸酐和吡啶體積比對枸櫞酸離子含量測定的影響

配制一定濃度的枸櫞酸鈉溶液（溶液1、2），按照中國藥典方法中乙酸酐與吡啶體積為5.7∶1.3 mL 時(shí)，測得的含量結(jié)果與配制濃度的比值結(jié)果不理想。當(dāng)體積比（mL）為5.1∶1.3、5.7∶1.5 時(shí)，檢測所得含量值與配制濃度的比值近似于100%，結(jié)果較好（表1）?？紤]為減少易制毒試劑乙酸酐的使用量，故改進(jìn)后方法選用乙酸酐和吡啶體積分別為5.1 mL 和1.3 mL。

表1 乙酸酐和吡啶體積比對枸櫞酸離子含量測定的影響

2.3 專屬性

取專屬性溶液上樣測定，測得吸光度值分別為0.000 0、0.000 1，結(jié)果顯示該溶液對枸櫞酸離子含量測定不產(chǎn)生干擾。

2.4 線性

將配制的線性溶液上樣測定，獲直線回歸方程為y=0.394 7x+0.055 5，相關(guān)系數(shù)r為0.997 9，該方法可測定含量范圍為22.32～66.96 mmol/L。

2.5 準(zhǔn)確度

取準(zhǔn)確度溶液1 mL 上樣測定，計(jì)算求得回收率。結(jié)果顯示3 組不同濃度的平均回收率（n=3）分別為100.6%、101.0%、98.79%，9 組準(zhǔn)確度溶液的回收率測得結(jié)果的平均值為100.1%（n=9），RSD 為1.48%（n=9）（表2），表明用所建立方法測得的含量值與加入量相比，基本接近，方法準(zhǔn)確度較好。

表2 回收率試驗(yàn)

2.6 精密度（重復(fù)性/中間精密度）

在不同的日期，由兩位實(shí)驗(yàn)員分別平行制備6 份供試品溶液，測定吸光度，并計(jì)算枸櫞酸離子含量。結(jié)果顯示兩位實(shí)驗(yàn)員測得12 份樣品中枸櫞酸離子含量的平均值為29.94 mmol/L，RSD 為1.57%（n=12），結(jié)果滿足自定接受標(biāo)準(zhǔn)（RSD ≤5.0%）（表3）。

表3 精密度（重復(fù)性/中間精密度）

2.7 溶液穩(wěn)定性

對照品溶液于2～8 ℃放置72 h、樣品溶液于室溫放置1 h 時(shí)所測得的枸櫞酸離子含量與0 時(shí)間點(diǎn)測得的含量的比值均在95.0%～105.0%之間，表明樣品和對照品穩(wěn)定性良好（表4）。

表4 溶液穩(wěn)定性

2.8 耐用性

對蛋白沉淀溫度、反應(yīng)水浴溫度及最大吸收波長稍作改變，考察本方法的耐用性，結(jié)果顯示各參數(shù)改變后測得的枸櫞酸離子含量與中國藥典規(guī)定條件下測得的比值均在95.0%～105.0%，滿足自定標(biāo)準(zhǔn)（95.0%～105.0%），說明該方法耐用性良好（表5）。

表5 耐用性結(jié)果

2.9 樣品檢測

取3 批豬纖維蛋白原進(jìn)行檢測，其枸櫞酸離子含量分別為29.61、29.58 和30.30 mmol/L，均符合纖維蛋白原枸櫞酸離子含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（不大于60 mmol/L），說明該方法的穩(wěn)定性好，檢測數(shù)值偏差較小。

3 討論

中國藥典中對反應(yīng)結(jié)束后的溶液放置條件沒有明確，造成實(shí)際應(yīng)用中會(huì)出現(xiàn)待測溶液褪色現(xiàn)象，其吸光度值出現(xiàn)較大變化等問題，且該變化存在不確定性，造成測定結(jié)果的重現(xiàn)性差。通過研究，明確放置條件，大大提高了樣品的吸光度值的穩(wěn)定性。

該方法的檢測數(shù)據(jù)專屬性強(qiáng)，線性和范圍、準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果良好，在后續(xù)產(chǎn)品檢測中重現(xiàn)性良好，可以作為豬纖維蛋白原中枸櫞酸離子含量的測定方法。本方法亦順利通過中國食品藥品檢定研究院的方法復(fù)核。

因本方法的反應(yīng)試劑用到了易制毒試劑乙酸酐，購買流程比較繁瑣；且本方法的時(shí)間性很強(qiáng)，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)試劑的加入量，對檢驗(yàn)人員操作熟練度要求也較高。所以下一步的研究將尋找一種更為簡便的方法。