朱其順， 李其琴， 汪樂飛， 段 方， 龐劍濤， 顏守保

（淮南師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 淮南 232038）

紅茶菌（胃寶）是一種傳統(tǒng)的民間發(fā)酵飲料，經(jīng)乙酸菌、酵母菌等多種微生物共同發(fā)酵而成[1-2]，含有多種對(duì)人體有益的物質(zhì)[3-4]，有預(yù)防和治療多種疾病以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[5-7]，是一種很有利用價(jià)值的天然微生物發(fā)酵產(chǎn)品[8]。 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅茶菌發(fā)酵工藝和菌種分離的研究[9-16]取得了一定進(jìn)展，但對(duì)紅茶菌風(fēng)味評(píng)價(jià)研究方面缺少系統(tǒng)的報(bào)道。 黃大茶是皖西大別山區(qū)特色茶類之一，其葉大、梗長(zhǎng)、湯色黃，具有典型的老火香，有提神、助消化、化痰止咳、降血糖等功效[17-18]。 草莓含有大量維生素、多種礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、果膠、有機(jī)酸等，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被稱為“水果皇后”[19]。

目前國(guó)內(nèi)已有紅茶菌發(fā)酵茶飲料方面的研究[20-22]，但市場(chǎng)上尚未見到果味黃大茶類發(fā)酵飲料。 作者以不同產(chǎn)地紅茶菌中分離篩選優(yōu)良菌株，以皖西大別山區(qū)黃大茶為主要原料，加入草莓果汁液和其他輔料，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化和產(chǎn)品調(diào)配等手段開發(fā)出一種草莓味茶發(fā)酵特色飲料產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

不同產(chǎn)地紅茶菌“胃寶”：網(wǎng)購(gòu)；特級(jí)黃大茶：皖西大別山區(qū)；精選草莓大果：安徽長(zhǎng)豐縣草莓基地。

酵母菌斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，瓊脂粉15~20 g，溶化后加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌25 min。

YEPD 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖50 g，酵母浸膏10 g，瓊脂15~20 g，蒸餾水1 L，自然pH。

乙酸菌分離培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，葡萄糖50 g，碳酸鈣10 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，121 ℃滅菌15 min，冷卻到50~60 ℃時(shí)，加入100 μg/mL 的制霉菌素和體積分?jǐn)?shù)2%的無水乙醇。

乙酸菌增殖和產(chǎn)酸培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母提取物10 g，115 ℃滅菌20 min，使用前加入體積分?jǐn)?shù)3%的無水乙醇。

1.2 種子培養(yǎng)

取數(shù)環(huán)斜面保藏的乙酸和酵母菌種，接入裝有100 mL 增殖培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶，30 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，制得乙酸菌和酵母菌種子液。

1.3 優(yōu)良菌株篩選

1.3.1 菌株篩選 取梯度稀釋紅茶菌液1 μL，涂布于分離培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h， 經(jīng)標(biāo)記和多次平板劃線獲得純菌株，4 ℃保藏。

1.3.2 優(yōu)良菌株的獲得

1）乙酸菌產(chǎn)酸能力測(cè)試 將200 mL 產(chǎn)酸培養(yǎng)基加入250 mL 三角瓶中，滅菌，在無菌條件下以體積分?jǐn)?shù)2%接種，30 ℃培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行產(chǎn)酸量檢測(cè)。

2）酵母菌發(fā)酵力分析 將200 mL 麥芽汁（250 g/L）加入250 mL 三角瓶中，滅菌后在無菌條件下加體積分?jǐn)?shù)5%的酵母菌種子液 （1×107CFU/mL），30 ℃培養(yǎng)7 d，檢測(cè)乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)琴|(zhì)量濃度。

3）發(fā)酵產(chǎn)物中可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)評(píng)價(jià) 將上述乙酸菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液通過GC-MS 分析可揮發(fā)性風(fēng)味成分。

4）發(fā)酵產(chǎn)物感官評(píng)價(jià) 對(duì)乙酸菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液進(jìn)行風(fēng)味感官評(píng)價(jià)。

5）目標(biāo)菌株鑒定 乙酸菌DNA 提取用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒 （上海生工），測(cè)定細(xì)菌16SrDNA 序列用PCR 擴(kuò)增試劑盒 （上海生工）。 引物為Eu27F：AGAGTTTGATCATGGCTCAG和1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT； 酵母菌DNA 提取用Ezup 柱式酵母基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工），測(cè)定酵母ITS 序列用PCR 擴(kuò)增試劑盒 （上海生工）。 引物為ITS1：TCCGTAGGTGAA CCTGCG 和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。 用EZ-10 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化后測(cè)序，結(jié)果提交GenBank 進(jìn)行BLAST 分析。 用ClustalX1.8 對(duì)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的菌株序列進(jìn)行比對(duì)（Aligment）， 用BioEdit 手工刪除兩端不齊序列，Mega 4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 并進(jìn)行1 000 次Bootstraps 檢驗(yàn)計(jì)算支持率。

1.4 茶發(fā)酵飲料的制作方法

圖1 為產(chǎn)品釀制工藝流程，主要步驟包括種子培養(yǎng)、糖茶汁制備、發(fā)酵、草莓汁制備、調(diào)配、澄清、殺菌包裝等。

圖1 草莓味黃大茶發(fā)酵飲料釀制工藝流程圖Fig. 1 Process flow chart of brewing strawberry-flavored yellow tea fermented beverage

1.4.1 種子培養(yǎng) 培養(yǎng)方法見1.2。

1.4.2 糖茶汁制備 將4 mg/L 的黃大茶煮沸5 min后用4 層紗布過濾，加入40 g/L 白砂糖液，冷卻至室溫后備用，每500 mL 藍(lán)口瓶中裝300 mL 糖茶汁并用八層紗布封口，113 ℃滅菌15 min 備用。

1.4.3 發(fā)酵 將乙酸菌種子液和酵母菌種子液按照一定接種體積分?jǐn)?shù)和接種比例接入糖茶汁液中，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

1.4.4 草莓汁制備 草莓鮮果和水按質(zhì)量比1∶3 比例榨汁，均質(zhì)后備用。

1.4.5 調(diào)配 將茶發(fā)酵液、草莓汁、水、蜂蜜、果葡糖漿、檸檬酸和檸檬酸鈉、VC 和D-異抗壞血酸鈉、食用香精等輔料按照一定比例調(diào)配，獲得初級(jí)產(chǎn)品。

1.4.6 澄清 將初級(jí)產(chǎn)品于4 000 r/min 離心15 min，保留上清液。

1.4.7 殺菌、包裝 上清液于113 ℃滅菌5 min，冷卻至常溫，無菌灌裝即為成品。

1.5 茶飲料發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

1.5.1 接種量和接種比例 將上述茶培養(yǎng)液中分別接入不同量和不同比例的乙酸菌株和酵母菌株，30 ℃發(fā)酵7 d，測(cè)產(chǎn)酸量并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5.2 初始pH 值 在1.5.1 的最佳條件下，將上述茶培養(yǎng)液pH 分別調(diào)節(jié)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；其他步驟同1.5.1。

1.5.3 發(fā)酵溫度 在1.5.2 最佳條件下， 將上述茶培養(yǎng)液中分別接入最佳量和最佳比例的混合菌種，分別于20、25、30、32、34 ℃靜置發(fā)酵7 d，測(cè)產(chǎn)酸量并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5.4 發(fā)酵時(shí)間 在最佳條件下靜置發(fā)酵15 d，第3 天開始每天取樣測(cè)定產(chǎn)酸量并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 調(diào)配工藝優(yōu)化

將獲得的發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH 至3.0， 用草莓汁調(diào)配，同時(shí)添加其他輔料，研究原料調(diào)配比例對(duì)茶發(fā)酵產(chǎn)品感官的影響，并獲得最佳的配比。

1.6.1 輔料添加量?jī)?yōu)化

1）單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以感官評(píng)分為指標(biāo)，分別對(duì)草莓汁添加量（g/L）、結(jié)晶糖漿添加量（g/L）、檸檬酸和檸檬酸鈉添加量（g/L）等3 個(gè)因素各取5 個(gè)梯度。 草莓汁為：1、3、5、7、9 g/L，結(jié)晶糖漿為：1、3、5、7、9 g/L， 檸 檬 酸 和 檸 檬 酸 鈉 為：0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L。

2）響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取單因素實(shí)驗(yàn)中感官評(píng)分最高的3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 草莓味發(fā)酵茶飲料實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼Table 1 Experimental factors and level coding of strawberry-flavored fermented tea beverage

1.6.2 模糊數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)方法

1）因素集的確立 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的集合為W=（w1，w2，w3，w4），其中w1、w2、w3、w4分別代表香氣、色澤、滋味、口感質(zhì)地4 個(gè)因素。

2）評(píng)語集的確立 評(píng)語集表示為ω=（ω1，ω2，ω3，ω4），其中ω1、ω2、ω3、ω4分別表示優(yōu)、良、中、差。

3）權(quán)重集的確立 根據(jù)層次分析法設(shè)定權(quán)重向量，記為X=（x1，x2，x3，x4）=（0.25，0.20，0.40，0.15），并且x1+x2+x3+x4=1，x1、x2、x3、x4分別表示香氣、色澤、滋味和口感質(zhì)地4 個(gè)因素的質(zhì)量權(quán)重。

借鑒邢慧雅等[23]的研究方法，由10 名作者所在學(xué)院食品專業(yè)高年級(jí)學(xué)生（男、女生各5 名）組成感官評(píng)價(jià)小組，采取密碼審評(píng)法，從香氣、色澤、滋味和口感質(zhì)地等4 個(gè)方面打分。

1.6.3 抗氧化劑添加量的確定 將茶發(fā)酵飲料分別添加不同比例和不同量的VC 和D-異抗壞血酸鈉，25 ℃靜置3 個(gè)月， 以未添加為對(duì)照組，540 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD 值，OD 值越小，抗氧化性越強(qiáng)。

1.6.4 食用香精添加量的確定 參照香精使用說明，添加多種香味香精。

1.7 分析方法

1.7.1 理化指標(biāo)分析 殘?zhí)菧y(cè)定采用DNS 法[24]；產(chǎn)酸量測(cè)定采用滴定法[25]，以乙酸計(jì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)測(cè)定采用蒸餾比重法[26]。

1.7.2 可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

1）頂空固相微萃?。℉S-SPME）條件 選取50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS 固相微萃取頭。 萃取條件：精確稱取3.0 g 樣品放入頂空瓶中，密封，于60 ℃水浴超聲波振蕩儀中平衡15 min，60 ℃水浴頂空萃取30 min， 將萃取頭取出解吸4 min， 進(jìn)行GC-MS 分析。

2）氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析條件 氣相色譜 條 件：DB-WAX 色譜 柱 （60 m×250 μm×0.25 μm）；手動(dòng)不分流進(jìn)樣；40 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫到180 ℃，保持1 min，以8 ℃/ min 升溫到230℃，保持7 min；高純度氦氣，流量為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI 電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度230 ℃。

GC-MS 分析：采用50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，自動(dòng)SPME 進(jìn)樣器，15 mL 樣品瓶，Agligent 7890N-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

3）定性與定量分析 定性分析：檢測(cè)質(zhì)譜揮發(fā)性風(fēng)味成分，與標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)的物質(zhì)（NIST）匹配，匹配度超過800 的判定結(jié)果保存；半定量分析：以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，先將樣品中的揮發(fā)性化合物的峰面積與2-辛醇峰面積之比來初步判斷，再根據(jù)2-辛醇質(zhì)量濃度進(jìn)行計(jì)算[27]。

4）數(shù)據(jù)處理方法 將樣品香味成分質(zhì)量濃度錄入SPSS22.0，計(jì)算出各主成分值，進(jìn)行主成分分析。

1.8 整體風(fēng)味感官評(píng)價(jià)

參照沈明浩[28]偏好度排序檢驗(yàn)評(píng)分，由感官評(píng)價(jià)小組對(duì)試樣的感官特性和整體特征進(jìn)行評(píng)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良發(fā)酵菌株的獲得

2.1.1 優(yōu)良乙酸菌株的篩選和鑒定 采用稀釋涂平板法，經(jīng)過多次分離純化，獲得10 個(gè)乙酸菌純菌株，編號(hào)分別為：1.乙酸菌AH-001；2.乙酸菌AH-002；3.乙酸菌SX-001；4.乙酸菌DZ-001；5.乙酸菌ZJ-001；6.乙酸菌BJ-001；7.乙酸菌BJ-002；8.乙酸菌LN-001；9.乙酸菌WH-001；10.乙酸菌QS-001。

將上述10 種乙酸菌菌株以體積分?jǐn)?shù)2%分別接種到乙酸菌產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d 后檢測(cè)其產(chǎn)酸量，可以看出，乙酸菌DZ-001 產(chǎn)酸能力最大，為3.18 g/L，見圖2。

圖2 不同菌株產(chǎn)酸情況Fig. 2 Acid production by different strains

按照1.3.2 的方法， 各菌株種子液按照體積分?jǐn)?shù)2%分別接種進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)， 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行整體感官風(fēng)味評(píng)價(jià)， 可以看出乙酸菌DZ-001 發(fā)酵液評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)最高，見圖3。

圖3 不同菌株酵素茶發(fā)酵液感官風(fēng)味評(píng)價(jià)Fig. 3 Sensory and flavor evaluation of the fermentation broth of fermented tea by different strains of bacteria

分別以上述10 株乙酸菌為發(fā)酵菌株， 按照1.3.2 中的方法獲得乙酸菌發(fā)酵液， 通過GC-MS 分析其中可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果見表2。

表2 不同乙酸菌發(fā)酵液可揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 2 Volatile flavor components in fermentation broth of different acetic acid bacteria 單位： μg/dL

表2 表明，10 株菌發(fā)酵產(chǎn)物中主要含有17 種可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)， 包括酸類 （4 種）、 烷烴類（4種）、醛酮類（3 種）、醇類（2 種）、酯類（1 種）、醚類化合物（2 種）和噻唑類（1 種）。 其中，乙酸菌DZ-001發(fā)酵液含有較高質(zhì)量濃度的乙酸、硅氧烷類、苯乙醇、酯類化合物等，可賦予該菌種發(fā)酵液較好的復(fù)合香氣。綜合以上分析結(jié)果，選擇乙酸菌DZ-001 作為發(fā)酵菌株。

測(cè)定乙酸菌DZ-001 的16S rDNA 序列，提交到NCBI-BLAST 上進(jìn)行比對(duì)，見圖4。 根據(jù)同源性最高（100%），初步鑒定為液化葡萄糖酸桿菌（Gluconacetobacter liquefaciens）。

圖4 乙酸菌DZ-001 菌株的分子發(fā)育樹Fig. 4 Molecular development tree of acetic acid bacteria DZ-001 strain

2.1.2 優(yōu)良酵母菌的獲得

1）目標(biāo)菌株篩選 通過分離篩選初步獲得10株菌落形態(tài)不同和聞香不同的酵母菌， 編號(hào)分別為： 酵母菌AH-001、 酵母菌SX-001、 酵母菌SX-002、酵母菌DZ-001、酵母菌ZJ-001、酵母菌BJ-001、酵母菌LN-001、酵母菌LN-002、酵母菌WH-001、酵母菌QS-001。 將10 種酵母菌株以體積分?jǐn)?shù)10%接種到糖質(zhì)量濃度為250 g/L 的麥芽汁中，30℃發(fā)酵7 d，每隔1 d 觀察發(fā)酵情況（觀察氣泡和鏡檢），7 d 后檢測(cè)乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)琴|(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。

表3 不同酵母菌發(fā)酵能力測(cè)試結(jié)果Table 3 Different yeast fermentation ability test results

從表3 可以看出， 酵母菌LN-001 發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)高、殘?zhí)琴|(zhì)量濃度低，發(fā)酵能力最強(qiáng)。 7 d 后該菌種發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.1%， 殘?zhí)琴|(zhì)量濃度26.9 g/L。 再分別以該10 株菌為發(fā)酵菌株，按照1.3.2 的方法獲得酵母菌發(fā)酵液，通過GC-MS 分析可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果見表4。

表4 不同酵母菌種發(fā)酵液可揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 4 Volatile flavor components in fermentation broth of different yeast strains 單位： μg/dL

表4 表明， 酵母菌發(fā)酵液中主要含有11 種可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類（4 種）、酸類（3 種）、酯類（3 種）和硅氧烷化合物（1 種）。酵母菌LN-001 發(fā)酵液中，質(zhì)量濃度較高的丙三醇、2，3-丁二醇、苯乙醇對(duì)香氣有促進(jìn)作用，而影響口感的異戊醇質(zhì)量濃度相對(duì)較低。

為了進(jìn)一步分析優(yōu)劣， 分別對(duì)10 種酵母菌發(fā)酵液進(jìn)行感官風(fēng)味評(píng)價(jià)，結(jié)果見表5。感官風(fēng)味評(píng)價(jià)結(jié)果表明，酵母菌LN-001 發(fā)酵液的產(chǎn)酸量、香氣、口感、風(fēng)味均優(yōu)于其他菌株，故選為發(fā)酵菌株。

表5 不同酵母菌發(fā)酵液感官評(píng)價(jià)Table 5 Volatile flavor components in fermentation broth of different yeast strains

2）菌株鑒定 測(cè)定酵母菌LN-001 的ITS 序列，提交到NCBI-BLAST 上進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定該酵母菌是Wickerhamomyces anomalus，見圖5。

圖5 酵母菌LN-001 菌株的分子發(fā)育樹Fig. 5 Molecular developmental tree of yeast LN-001 strain

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 接種體積分?jǐn)?shù)和接種比例的確定 乙酸菌DZ-001 和酵母菌LN-001 的接種比例和接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)混菌發(fā)酵茶飲料的影響見表6。 當(dāng)乙酸菌DZ-001 和酵母菌LN-001 接種體積比為2∶1， 總接種體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到最大值。

表6 接種體積分?jǐn)?shù)和接種比例對(duì)混菌發(fā)酵茶飲料的影響Table 6 Effect of inoculation amount and inoculation ratio on the fermented tea beverage by mixed bacteria

2.2.2 初始pH 值的確定 表7 是不同初始pH 值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 可以看出，當(dāng)起始pH 值為5.5 時(shí)，產(chǎn)酸量最高，感官評(píng)價(jià)得分最高。

表7 起始pH 對(duì)混菌發(fā)酵茶飲料的影響Table 7 Effect of initial pH on the fermented tea beverage by mixed bacteria

2.2.3 發(fā)酵溫度的確定 從表8 可知，在溫度為30℃時(shí)，產(chǎn)酸量較大，感官評(píng)價(jià)得分最高。

表8 溫度對(duì)混菌發(fā)酵茶飲料的影響Table 8 Effect of temperatures on the fermented tea beverages by mixed bacteria

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間的確定 表9 表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)， 發(fā)酵液中產(chǎn)酸量不斷增大，10 d 后趨于穩(wěn)定。其中發(fā)酵時(shí)間為12 d 時(shí)，感官評(píng)價(jià)得分最高，這與徐小倩的研究結(jié)果一致[29]。

表9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混菌發(fā)酵茶飲料的影響Table 9 Effect of fermentation time on the fermented tea beverage by mixed bacteria

2.3 輔料添加量的優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 圖6 表明，當(dāng)草莓果汁添加質(zhì)量濃度為3 g/L、結(jié)晶糖漿添加質(zhì)量濃度為4 g/L、檸檬酸和檸檬酸鈉添加質(zhì)量濃度為3 g/L 時(shí)， 感官評(píng)分最高。

圖6 各因素對(duì)草莓味酵素茶感官評(píng)價(jià)的影響Fig. 6 Effect of various factors on the sensory evaluation of strawberry-flavored fermented tea

2.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)：u(píng)判

1）響應(yīng)面模糊評(píng)判結(jié)果 以香氣、色澤、滋味、口感質(zhì)地4 個(gè)因素為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)17組不同樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，每組樣品指標(biāo)等級(jí)的得票數(shù)/總參評(píng)數(shù)（10 人），得到模糊矩陣D1~D17。

2）模糊變換及綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)模糊變換的原理G=X·D， 則第j 號(hào)樣品評(píng)價(jià)結(jié)果表示為Gj=X·Dj（X為權(quán)重，j 為1~17 號(hào)）。將Gj乘以其相應(yīng)的子集分?jǐn)?shù)值，結(jié)果求和得到綜合評(píng)定的分?jǐn)?shù)，然后進(jìn)行多元回歸擬合，得到以感官分值為目標(biāo)函數(shù)的模型：Y1=92.20-0.88A1+0.75B1+0.62C1+1.50A1B1+0.75A1C1-1.00B1C1-2.23A12-4.97B12-2.72C12。 對(duì)所得模型進(jìn)行回歸系數(shù)及顯著性測(cè)驗(yàn)，結(jié)果見表10。

表10 回歸系數(shù)及其顯著性測(cè)驗(yàn)結(jié)果Table 10 Regression coefficient and its significance test results

由表10 可知，A1>B1>C1且3 個(gè)因素都顯著；交互項(xiàng)A1C1不顯著，B1C1顯著，A1B1極顯著；二次項(xiàng)都為極顯著。 總模型的概率P< 0.000 1，為極顯著。 同時(shí)失擬項(xiàng)P=0.788 0，表示模型擬合良好。 相關(guān)系數(shù)R2=0.982 6，說明響應(yīng)值的變化有98.26%來源于所選變量。

3）響應(yīng)面分析及最優(yōu)條件確定 模型的響應(yīng)面和等高線圖見圖7。可以看出，影響感官評(píng)價(jià)得分的分別是：A1>B1>C1。 比較3 個(gè)等高線圖，交互作用顯著性程度為：A1B1>B1C1>A1C1。

圖7 輔料添加量對(duì)感官評(píng)價(jià)的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 7 Response surface and contour plot of the additives amount to sensory evaluation

通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化和平行驗(yàn)證試驗(yàn)，將酵素茶最佳調(diào)配工藝修正為：草莓果汁添加質(zhì)量濃度4.66 g/L、結(jié)晶糖漿添加質(zhì)量濃度5.08 g/L、檸檬酸和檸檬酸鈉總添加質(zhì)量濃度0.20 g/L。 實(shí)際感官評(píng)價(jià)得分為92 分，與理論預(yù)測(cè)值相近，說明該模型與實(shí)際情況擬合良好。

2.4 抗氧化劑添加量的確定

由表11 中OD 值和感官得分情況綜合評(píng)判，VC 和D-異抗壞血酸鈉的最佳添加量分別確定為0.02、0.03 g/L。

表11 不同抗氧化劑添加量對(duì)草莓味茶酵素特性影響Table 11 Effects of different antioxidant amounts on the properties of strawberry-flavored fermented tea

2.5 食用香精添加量

草莓香精按照使用說明書上推薦的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，效果良好。

3 結(jié) 語

從不同產(chǎn)地紅茶菌“胃寶”中分離篩選乙酸菌和酵母菌，通過發(fā)酵性能測(cè)試、發(fā)酵產(chǎn)物可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析、總體感官評(píng)價(jià)和分子生物學(xué)鑒定等方法，分別獲得一株優(yōu)良乙酸菌和酵母菌；再以大別山區(qū)黃大茶為主要原料，加入草莓汁，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化和產(chǎn)品調(diào)配優(yōu)化等手段開發(fā)草莓味黃大茶發(fā)酵飲料，并獲得最佳工藝參數(shù)。 研究結(jié)果為黃大茶和草莓資源產(chǎn)業(yè)化利用、提升其附加值、帶動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供依據(jù)。