張康，趙婷婷，張波，高夢琦，李昱熹，王邵鵬，趙文景*

IgA 腎?。╥mmunoglobulin A nephropathy，IgAN）是世界范圍常見的原發(fā)性腎小球腎炎［1］，占我國原發(fā)性腎小球腎炎的52.66%［2］，25%～30%的IgAN 患者在確診后20 年內(nèi)會進展至終末期腎病［3］，成為家庭和國民經(jīng)濟的沉重負擔(dān)。目前尚無針對IgAN 有效且安全的治療方案。2021 年改善全球腎臟病預(yù)后組織（KDIGO）指南推薦IgAN 的治療重點是優(yōu)化支持治療，包括血壓管理、使用最大耐受劑量的腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑（renin-angiotensin system inhibitors，RASI）、 生活方式改變等；對于經(jīng)過了至少90 d 的優(yōu)化支持治療，仍有疾病進展風(fēng)險的IgAN 患者可以考慮為期6 個月的皮質(zhì)類固醇治療［4］。然而，糖皮質(zhì)激素的長期療效和安全性仍存在爭議，STOP-IgAN 研究顯示在高危IgAN患者中加強免疫抑制治療并不能延緩估算腎小球濾過率（eGFR）下降，且不良反應(yīng)明顯增加［5］；TESTING研究顯示足量激素治療IgAN 可顯著減少蛋白尿，減少63%的腎衰竭事件，但嚴重不良事件風(fēng)險增加4.63 倍［6］。

近年來針對IgAN 治療的新藥研究進展迅速，其中靶向遲釋布地奈德膠囊是全球首個IgAN 對因治療藥物。2022 年10 月，布地奈德腸溶膠囊的Ⅲ期臨床試驗NeflgArd 公布了其研究結(jié)果，表明布地奈德腸溶膠囊在降低蛋白尿方面具有顯著優(yōu)勢，且腎功能穩(wěn)定，無嚴重不良反應(yīng)發(fā)生，但其治療IgAN 的作用機制尚未完全明確［7］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索布地奈德治療IgAN 的作用靶點，進行藥物-疾病靶點相互作用分析、基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，為布地奈德治療IgAN 的臨床實踐提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 布地奈德基本信息的獲取 通過Chemical Book（https://www.Chemical Book.com/）獲取布地奈德的分子式和結(jié)構(gòu)式。

1.2 布地奈德作用靶點的篩選及靶點信息的規(guī)范化 布地奈德相關(guān)基因通過人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（https://www.genecards.org/）輸入關(guān)鍵詞“Budesonide”獲得，數(shù)據(jù)庫更新截止時間為2023 年3 月。利用DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca）與TTD 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.net/ttd/）對相關(guān)靶點進一步補充，所預(yù)測的藥物靶點信息與Uriprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進行規(guī)范化處理后確定為布地奈德主要靶點。

1.3 獲取IgAN 相關(guān)靶基因 通過GeneCards 和CTD 數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org/），輸入關(guān)鍵詞“IgA nephropathy”，獲得IgAN 相關(guān)基因。通常在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，當(dāng)靶基因數(shù)目較多時可將Score 值＞中位數(shù)的靶基因作為疾病的潛在靶基因。本研究中通過GeneCards 獲得的相關(guān)靶基因數(shù)目中等，因此未進行篩選，全部納入研究。其中得到Score 最大值為73.96，最小值為0.26。利用CTD 數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，并使用韋恩圖將兩個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果取交集獲得IgAN 的最終靶點。

1.4 布地奈德-IgAN 交集靶點 將布地奈德相關(guān)靶點與IgAN 靶點導(dǎo)入Venny 2.1.0 網(wǎng)站（https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/Index.html），通過韋恩圖取交集獲得共同靶點。

1.5 藥物-疾病靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將布地奈德和布地奈德-IgAN 共同靶基因?qū)隒ytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖。以“節(jié)點”表示藥物成分與作用靶點，以“邊”表示節(jié)點間的相互作用。

1.6 蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用（protain-protain interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）中輸入交集靶基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，利用CytoNCA 插件計算各節(jié)點的度值和介數(shù)，≥度值中位數(shù)的靶點被定義為關(guān)鍵靶點。

1.7 GO 和KEGG 通路富集分析 通過Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org）對共同靶基因進行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三部分。篩選條件Min Overlap 為3；P Value Cutoff 為0.01；Min Enrichment為1.5，并用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）可視化分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 布地奈德及IgAN 相關(guān)靶點的篩選 藥物布地奈德的基本信息見圖1。共獲得布地奈德靶點242 個，IgAN相關(guān)基因1 443 個。通過韋恩圖取并集獲得146 個布地奈德-IgAN 共同靶基因，約占總數(shù)的9.5%，見圖2。

圖1 布地奈德基本信息Figure 1 Basic information of budesonide

圖2 布地奈德-IgAN 共同靶點韋恩圖Figure 2 Venn diagram of the intersection of budesonide and IgA nephropathy targets

2.2 布地奈德-IgAN 共同靶基因網(wǎng)絡(luò)分析 以布地奈德和146 個布地奈德-IgAN 共同靶基因構(gòu)建“藥物-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，中心橙色節(jié)點代表布地奈德，周邊146 個綠色節(jié)點代表布地奈德治療IgAN 的潛在靶點，146 條邊代表布地奈德-IgAN 之間的相互作用，見圖3。

圖3 布地奈德-IgAN 靶基因網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Budesonide-IgAN target genes network

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 于STRING 數(shù)據(jù)庫中輸入146 個布地奈德-IgAN 共同靶基因，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置篩選條件后獲得143 個節(jié)點，1 022 條邊，見圖4。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中，利用CytoNCA 插件計算各節(jié)點的度值和介數(shù)的中位數(shù)分別為34.0、810.67，以≥度值中位數(shù)對靶點進行篩選，共獲得15 個關(guān)鍵靶基因：白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素10（IL-10）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）等，見圖5、表1。

表1 PPI 網(wǎng)絡(luò)15 個關(guān)鍵靶基因及其拓撲參數(shù)Table 1 15 core target genes of PPI network and their topological parameters

圖4 布地奈德-IgAN 交集靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 PPI network map of the intersection of budesonide and IgAN targets

圖5 15 個關(guān)鍵靶基因Figure 5 15 core target genes

2.4 GO 富集分析 應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)庫將146 個交集靶基因進行GO 功能富集，共得到1 646 個BP，62 個CC 及127 個MF，其中BP 主要涉及炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、磷酸化的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of phosphorylation）、細胞運動的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of cell motility）等；CC 主要涉及囊腔（vesicle lumen）、細胞質(zhì)囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）等；MF主要涉及信號受體激活活性（signaling receptor activator activity）、 信號受體調(diào)節(jié)活性（signaling receptor regulator activity）、 受體配體活性（receptor ligand activity）等。使用微生信平臺按照P 值排序?qū)⑴琶?0 的富集分析結(jié)果繪制出氣泡圖，圖中圓點大小代表基因個數(shù)，顏色對應(yīng)P 值大小，見圖6～8。

圖6 布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵靶點的GO-BP 富集分析Figure 6 GO-BP enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

圖7 布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵靶點的GO-CC 富集分析Figure 7 GO-CC enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

圖8 布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵靶點的GO-MF 富集分析Figure 8 GO-MF enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

2.5 KEGG 信號通路富集分析 將146 個交集靶基因通過Metascape 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 富集分析，共獲得174條信號通路。對前20 條信號通路制作KEGG 信號通路柱狀圖（圖9），縱坐標(biāo)是信號通路的名稱，橫坐標(biāo)是富集在每條通路上基因的數(shù)目，不同的顏色代表不同的P 值，顏色越紅，P 值越小，富集越明顯，說明此通路與疾病的相關(guān)性越大。結(jié)果顯示富集基因較多且富集明顯的通路包括細胞因子-細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、白介素17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、癌癥中的通路（pathways in cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等。

圖9 布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵信號通路Figure 9 Key signaling pathways of IgAN treated with budesonide

3 討論

黏膜免疫缺陷導(dǎo)致半乳糖缺陷IgA1 分子（galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1）的產(chǎn)生在IgAN 發(fā)病機制中具有重要意義［8］，因此，從病因出發(fā)尋找新型治療方案是當(dāng)前IgAN 的研究重點。

近年來，作為黏膜免疫系統(tǒng)最廣泛、最重要的部位，腸道黏膜免疫系統(tǒng)在IgAN 發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注［9］。腸道黏膜免疫系統(tǒng)擁有全身最廣泛的黏膜相關(guān)淋巴組織——腸道相關(guān)淋巴組織（GALT），對腸道局部和全身免疫均發(fā)揮作用。其中，派爾集合淋巴結(jié)是GALT 中抗原采集和免疫誘導(dǎo)的主要部位，也是人體IgA1 分子的主要來源［10］，有促進B 細胞向分泌IgA 的漿細胞分化的微環(huán)境。B 細胞分化成IgA 漿細胞后，錯位遷移至全身，導(dǎo)致循環(huán)Gd-IgA1 過多，可能是IgAN 發(fā)病的基礎(chǔ)和源頭［11］。布地奈德腸溶膠囊作為一種靶向腸道釋放的糖皮質(zhì)激素在IgAN 的治療中顯示出了獨特的優(yōu)勢，其靶向釋放于回腸末端的黏膜B 細胞，達到從上游減少誘發(fā)IgAN 的Gd-IgA1 產(chǎn)生從而治療IgAN 的作用［7］。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對布地奈德治療IgAN的作用機制進行了探索。研究結(jié)果表明IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、EGFR 等處于布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵靶點的核心位置。IL-6、TNF-α、IL-10 均屬于炎癥細胞因子，IgAN 患者血清IL-6、TNF-α、IL-10 水平顯著升高［12-13］。作為一種促炎細胞因子，IL-6 是腎上腺TOLL 樣受體（TLR）9 激活介導(dǎo)IgA1 過度生成的主要分子之一，IL-6 不僅可以誘導(dǎo)Gd-IgA1 的過量產(chǎn)生，亦可介導(dǎo)系膜細胞增殖和基質(zhì)擴張，并促進腎臟炎性細胞浸潤，從而誘發(fā)疾病生成［14-15］；此外，臨床研究顯示IgAN 患者尿液IL-6 水平異常升高，與腎臟病理損傷呈正相關(guān)，提示IL-6 可作為一種無創(chuàng)性生物標(biāo)志物，反應(yīng)IgAN 的腎臟損傷情況［16］。TNF-α 可通過與IgAN 足細胞TNF-α 受體1（TNFR1）結(jié)合介導(dǎo)足細胞凋亡，從而引發(fā)蛋白尿［17-18］。IL-10 在IgAN 腎內(nèi)的表達主要發(fā)生在腎小管區(qū)域，作為一種抗炎細胞因子，IL-10 可通過減少IL-1β 的合成來抑制炎癥反應(yīng)［19］，亦可下調(diào)TNF 的合成［20］。此外，一項在中國西北地區(qū)人群中展開的研究表明IL-10 是IgAN 患者的易感基因［21］，IL-10 基因G-1082A 多態(tài)性與IgAN 進展相關(guān)［22］。VEGFA 是一種重要的血管內(nèi)皮生長因子，對維持腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞、足細胞和壁層上皮細胞的存活、分化和結(jié)構(gòu)至關(guān)重要［23］，腎小管VEGFA 產(chǎn)生的增加會導(dǎo)致纖維化和腎小球病變［24］。VEGFA 在IgAN患者腎臟頂葉上皮細胞、腎小管上皮細胞、足細胞和系膜細胞中強烈表達，尿液VEGFA 水平與腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化顯著相關(guān)，是IgAN 的獨立預(yù)后因素［25］。EGFR 是一種多功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子，過量的EGFR 可激活PI3K/Akt 通路，增加TGF-β1 的含量，促進腎臟纖維化，并增加炎癥細胞因子的產(chǎn)生［26］。

對關(guān)鍵靶點進行GO 富集分析，其中BP 主要涉及磷酸化的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細胞運動的正向調(diào)節(jié)等，CC 主要涉及細胞質(zhì)囊泡腔、囊腔、分泌顆粒腔等，MF 主要涉及信號受體激活活性、信號受體調(diào)節(jié)活性、受體配體活性等。KEGG 富集分析顯示，布地奈德可通過多條信號通路調(diào)控IgAN，其中細胞因子與細胞因子受體相互作用的通路在布地奈德治療IgAN 中起到了關(guān)鍵作用。細胞因子作為機體內(nèi)最具有活性的可溶性多肽，從生物酶活力、細胞膜通透性、細胞骨架蛋白功能、基因表達等多方面參與機體生理病理狀態(tài)，細胞因子-細胞因子受體網(wǎng)絡(luò)是機體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，也是藥物干預(yù)的靶點和核心環(huán)節(jié)［27］。IgAN 與黏膜感染相關(guān)，常伴有細胞因子升高，IgAN 患者細胞因子-細胞因子受體相互作用通路在細菌感染宿主的炎癥過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。其中IL-6 作為促炎因子，在機體發(fā)生感染時可發(fā)出炎癥信號，促進免疫細胞增殖分化。在IgAN 患者中，IL-6 可通過調(diào)節(jié)ST6GALNAC2和C1GALT1 的基因表達及酶活性，上調(diào)IgA1 分子的半乳糖缺失，進而增加免疫復(fù)合物形成、促進疾病進展［28］。因而，布地奈德通過調(diào)控細胞因子-細胞因子受體相互作用通路抑制Gd-IgA1 合成在IgAN 的治療中具有重要意義。

綜上所述，本研究初步探討了布地奈德治療IgAN的藥理學(xué)機制。布地奈德可能通過IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、EGFR 等靶點作用于細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、白介素17 信號通路、癌癥中的通路、腫瘤壞死因子信號通路等多條信號發(fā)揮IgAN 治療作用，為布地奈德治療IgAN 進一步研究提供了理論依據(jù)，后續(xù)可通過基礎(chǔ)實驗進一步驗證。

作者貢獻：張康設(shè)計文章的思路與框架，繪制圖表，撰寫論文初稿；張波、高夢琦進行文獻收集、整理和提煉；李昱熹、王邵鵬進行論文的修訂；趙婷婷、趙文景負責(zé)論文終稿的審定，文章的質(zhì)量控制及審校；張康、趙文景對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。