李亞南，葛國(guó)琴，陳江琳，崔傳堅(jiān)，金龍*，侯如燕*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶樹生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；3.洽洽食品股份有限公司，安徽 合肥 230601）

花椒是（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）蕓香科植物青椒或花椒的干燥成熟果皮[1-2]，全世界約有250 種，我國(guó)約有45 種和14 個(gè)變種[3]，按照果實(shí)顏色分為紅花椒和青花椒?；ń肪哂刑厥獾男?、麻、香味[4]，是一種典型的藥食同源的植物[5]，位列衛(wèi)健委公布的既是食品又是藥品的中藥名單，有治療肝損傷[6]、抑菌殺蟲[7-10]、緩解疼痛、消炎[11-13]、抗氧化、抗癌[14-19]等作用。花椒的活性化學(xué)物質(zhì)豐富，富含揮發(fā)油[20]、酰胺類物質(zhì)[21]、生物堿[22]、香豆素[23]、木脂素[24]和脂肪酸[25]等。目前，脂肪酸分析技術(shù)主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、紅外光譜法、質(zhì)譜法以及薄層層析法[26]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于花椒的研究主要集中在栽培技術(shù)[27]、采后干制、加工技術(shù)[28]以及花椒揮發(fā)油的含量、化學(xué)組成等方面。候麗秀[28]對(duì)不同地區(qū)青花椒籽和紅花椒籽進(jìn)行油脂萃取，再利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對(duì)籽油進(jìn)行脂肪酸測(cè)定。曹蕊等[3]采用索氏抽提法從花椒中提取花椒油，用GC-MS 進(jìn)行分析并對(duì)兩種花椒油的脂肪酸組成和相對(duì)含量進(jìn)行比較。張仁鳳等[29]采用GC-MS 對(duì)6 個(gè)不同產(chǎn)地紅花椒籽油的脂肪酸組成進(jìn)行了分析。已有的研究分析了不同產(chǎn)地花椒的脂肪酸種類，表明花椒樣品的脂肪酸組成與產(chǎn)地存在一定的相關(guān)性。

在我國(guó)花椒主要產(chǎn)自四川、陜西等地，產(chǎn)地不同造成市場(chǎng)價(jià)格差異。本文選取陜西、山東、四川、甘肅4個(gè)省份共32 份花椒，并對(duì)脂肪酸成分進(jìn)行提取，結(jié)合氣相色譜法對(duì)其進(jìn)行分析。利用37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品確定脂肪酸成分并采用外標(biāo)法確定各成分的含量。進(jìn)一步采用方差分析和多重比較分析不同省份花椒脂肪酸組分的顯著性差異，進(jìn)一步探究花椒的脂肪酸含量及其組成差異與產(chǎn)地的相關(guān)性，旨在為花椒在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒樣品（干制品）：來自陜西韓城8 份，山東泰安、棗莊各4 份，四川漢源2 份、茂汶6 份，甘肅天水3份、隴南4 份、臨夏1 份，4 個(gè)省份共計(jì)32 份樣品。所有樣品均自行采摘，在未檢測(cè)分析前均在-20 ℃避光密封保存。

鹽酸（分析純）、焦性沒食子酸（C6H6O3、分析純）：西隴化工股份有限公司；石油醚（沸程30～60 ℃、色譜純）：無錫市展望化工試劑有限公司；正己烷（C6H14、色譜純）、氫氧化鈉（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇（純度95%，色譜純）：宿州眾望健康科技有限公司；甲醇（色譜純）：安徽高地高純?nèi)軇┯邢薰?；正庚烷（色譜純）：上海躍勝貿(mào)易有限公司；三氟化硼甲醇溶液（純度15%，色譜純）、37 種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀（Agilent 7890B）：美國(guó)安捷倫科技公司；研磨機(jī)：浙江蘇泊爾有限公司；PL403 電子天平（精確度0.1 mg）：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；恒溫水浴鍋（40～100 ℃，控溫±1 ℃）：上海申賢恒溫設(shè)備廠；RV-10digitalV 數(shù)顯型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)艾卡集團(tuán)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取出適量脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品移至10mL 容量瓶中，用正庚烷稀釋定容成50、100、500、1 000、2 500 mg/L和5 000 mg/L 6 個(gè)濃度，貯存于-20 ℃冰箱，過濾膜后裝瓶待測(cè)。

1.3.2 脂肪酸的提取

在GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》[30]的基礎(chǔ)上改進(jìn)了溶劑，以正己烷代替乙醚[31]，對(duì)花椒的脂肪酸成分進(jìn)行提取，減少了測(cè)定樣品中雜質(zhì)的產(chǎn)生且在一定程度上提高了試驗(yàn)的安全性和穩(wěn)定性。

先將花椒樣品使用研磨機(jī)粉碎，稱取均勻試樣1.0 g移入到250 mL 平底燒瓶中，加入100 mg 焦性沒食子酸，再加入2 mL 95%乙醇和4 mL 水，混勻；加入鹽酸溶液10 mL，混勻。將燒瓶放入75 ℃水浴中水解40 min。每隔10 min 振蕩一下燒瓶，使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。

水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫。水解后的試樣，加入10 mL 95%乙醇，混勻。將燒瓶中的水解液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用50 mL 正己烷石油醚混合液沖洗燒瓶和塞子，沖洗液并入分液漏斗中，加蓋。振搖5 min，靜置10 min。將醚層提取液收集到250 mL 燒瓶中。按照以上步驟重復(fù)提取水解液3 次，最后用正己烷石油醚混合液沖洗分液漏斗，并收集250 mL 燒瓶中。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，殘留物為脂肪提取物。在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8 mL，連接回流冷凝器，（80±1）℃水浴上回流，直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，在（80±1）℃水浴中繼續(xù)回流2 min。用少量水沖洗回流冷凝器。停止加熱，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫。準(zhǔn)確加入20 mL 正庚烷，振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取溶液5 mL至25 mL 試管中，加入大約4 g 無水硫酸鈉，振搖1 min靜置5 min，吸取上層溶液到進(jìn)樣瓶中待測(cè)定。

1.3.3 色譜柱及程序升溫條件

HP-88 毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm）；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；FID 檢測(cè)器溫度：280 ℃；程序升溫：起始溫度100 ℃，保持13 min，以10 ℃/min 升至180 ℃，保持6 min，再以1 ℃/min 升至200 ℃，保持20 min，再以4 ℃/min 升至230 ℃，保持10.5 min；載氣為高純度氮?dú)猓∟299.999%）；分流比20∶1；進(jìn)樣體積1.0 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 進(jìn)行花椒脂肪酸數(shù)據(jù)處理分析并制作37 種混合脂肪酸甲酯溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線；脂肪酸含量柱形圖采用GraphPad Prism 7.00 軟件完成；單因素方差分析采用GraphPad Prism 7.00 和IBM SPSS Statistics 22.0 軟件完成；層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和相關(guān)性分析采用Matlab 軟件完成；熱圖采用HemI 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸的GC 檢測(cè)

按照1.3.3 中的方法對(duì)6 個(gè)濃度梯度的37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行GC 檢測(cè)，以5 000 mg/L 濃度的色譜圖為代表，如圖1a 所示。按照1.3.2 中的方法提取32 個(gè)不同產(chǎn)地的花椒脂肪酸成分并進(jìn)行GC 檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，隨機(jī)以茂汶、隴南、泰安、韓城4 處的色譜圖分別作為四川、甘肅、山東、陜西4 省花椒樣品色譜圖，如圖1b～圖1e 所示。

圖1 37 種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和花椒中脂肪酸甲酯組分的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatography profiles of mixed methyl fatty acid for 37 standard and Zanthoxylum bungeanum

從色譜圖中可以看出，4 省花椒樣品所含主要脂肪酸組分出峰時(shí)間大致相同，但峰高有所不同。

2.2 脂肪酸的定性定量結(jié)果

不同省份花椒脂肪酸含量見表1。

表1 不同省份花椒脂肪酸含量Table 1 Fatty acid content of Zanthoxylum bungeanum from different provinces

采用外標(biāo)法，通過6 個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積A 之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線A=kC＋B[32-33]。37 種脂肪酸在50～5 000 mg/L 線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2在0.99～0.999 9 之間，線性關(guān)系良好。通過GC檢測(cè)與定性分析，共鑒定出16 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸均有8 種。4 省份共有的脂肪酸有12 種，其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸均有6 種。

四川和山東花椒樣品均檢測(cè)出15 種脂肪酸，在4 省中種類最多。四川花椒樣品飽和脂肪酸有8 種，不飽和脂肪酸有7 種，順-順-順-9，12，15-十八碳三烯酸未檢出；山東花椒樣品飽和脂肪酸有7 種，不飽和脂肪酸有8 種，十七碳酸未檢出；陜西花椒樣品共檢測(cè)出14 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸均有7 種，順-順-順-9，12，15-十八碳三烯酸和二十二碳酸未檢出；甘肅花椒樣品共檢測(cè)出13 種脂肪酸，在4 省中種類最少，其中飽和脂肪酸有7 種，不飽和脂肪酸有6 種，十七碳酸、順-10-十七碳一烯酸和順-順-順-9，12，15-十八碳三烯酸未檢出。順-11-二十碳一烯酸（花生烯酸）、順-9-十八碳一烯酸（油酸）、順-順-9，12-十八碳二烯酸（亞油酸）、十六碳酸（棕櫚酸）和順-9-十六碳一烯酸（棕櫚油酸）5 種脂肪酸的含量明顯高于其他脂肪酸，而甘肅省樣品順-9-十六碳一烯酸（棕櫚油酸）的含量明顯低于其他3 省份。陜西、山東和四川花椒樣品所含脂肪酸含量最高的均為順-11-二十碳一烯酸（花生烯酸），而甘肅花椒樣品含量最高的為順-9-十八碳一烯酸（油酸）。

在表1 中共有8 組脂肪酸含量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差略大于均值，說明這些數(shù)據(jù)較離散并存在異常值。不同產(chǎn)地雖在行政區(qū)域上隸屬于同一省份，但地理位置有時(shí)相差甚遠(yuǎn)，甚至毗鄰其他省份，推測(cè)可能是造成數(shù)據(jù)存在異常值的原因，但大部分的結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是合理的。

2.3 不同省份花椒脂肪酸的顯著性差異分析

在統(tǒng)計(jì)學(xué)中，差異顯著性檢驗(yàn)是用于檢測(cè)試驗(yàn)組之間是否有差異及差異是否顯著的方法，方差分析用于兩個(gè)及兩個(gè)以上樣本均數(shù)差別的顯著性檢驗(yàn)。將4 個(gè)省份32 份花椒樣品每份做3 個(gè)平行，共96 個(gè)樣本通過GC 檢測(cè)與定性定量分析，利用脂肪酸的種類和含量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以產(chǎn)地為因子，以脂肪酸含量為因變量，結(jié)果見圖2。多重比較檢驗(yàn)見表2。

圖2 4 個(gè)省份花椒脂肪酸含量Fig.2 Fatty acid content of Zanthoxylum bungeanum from four provinces

表2 多重比較檢驗(yàn)Table 2 Multiple comparisons test

續(xù)表2 多重比較檢驗(yàn)Continue table 2 Multiple comparisons test

由圖2 可知，在方差分析多重比較結(jié)果中，己酸、順-10-十七碳一烯酸、順-順-順-9，12，15-十八碳三烯酸和順-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸共4 種脂肪酸在陜西、山東、四川和甘肅4 省份花椒樣品中無顯著性差異，其余12 種脂肪酸均有不同程度的顯著性差異（見表2），可以作為花椒產(chǎn)地鑒別的有效指標(biāo)。通過使用IBM SPSS Statistics 22.0 分析來自陜西、山東、四川和甘肅省花椒樣品之間脂肪酸數(shù)據(jù)的顯著性差異，進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)顯著性結(jié)果與GraphPad Prism 7.00 一致。

對(duì)4 省份共32 份花椒樣品脂肪酸進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 4 個(gè)省份不同花椒聚類圖Fig.3 Dendrogram of Zanthoxylum bungeanum from four provinces

層次聚類分析圖以更加簡(jiǎn)單、直觀的方式反映各省份花椒樣品脂肪酸種類和含量的差異。結(jié)果表明，陜西和山東、四川和甘肅的部分樣品有交叉。

基于花椒樣品的脂肪酸組分建立熱圖，結(jié)果見圖4a。

圖4 4 個(gè)省份熱圖和相關(guān)性熱圖分析Fig.4 Heat map and correlation heat map analysis of Zanthoxylum bungeanum from four provinces

在相關(guān)性熱圖分析中，相關(guān)系數(shù)r 是研究變量之間線性相關(guān)程度的指標(biāo)，當(dāng)公式中X（產(chǎn)地）和Y（脂肪酸含量）的相關(guān)程度最高時(shí)，r 接近1，顏色為紅色。相關(guān)性熱圖分析見圖4b。

由圖4a 可知，陜西、山東、四川和甘肅4 個(gè)省份的樣品中順-9-十六碳一烯酸、十八碳酸和順-順-順-6，9，12-十八碳三烯酸3 種脂肪酸的變化趨勢(shì)相近；順-10-十七碳一烯酸、順-9-十八碳一烯酸、順-順-9，12-十八碳二烯酸、順-順-順-9，12，15-十八碳三烯酸、順-11-二十碳一烯酸和順-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸6 種脂肪酸的變化趨勢(shì)相近；二十一碳酸、二十二碳酸、二十三碳酸3 種脂肪酸的變化趨勢(shì)相近。

由圖4b 可知，4 個(gè)省份的花椒樣品中順-9-十八碳一烯酸、順-順-9，12-十八碳二烯酸、順-順-順-9，12，15-十八碳三烯酸、順-11-二十碳一烯酸、順-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸共5 種脂肪酸的含量呈正相關(guān)，相關(guān)性程度較高。

3 結(jié)論

陜西、山東、四川和甘肅4 個(gè)省份的花椒樣品共鑒定出16 種脂肪酸，其中共有脂肪酸12 種。四川和山東樣品均檢測(cè)出15 種脂肪酸；陜西共檢測(cè)出14 種脂肪酸；甘肅共檢測(cè)出13 種脂肪酸，在4 省中種類最少。方差分析和多重比較結(jié)果表明，不同省份花椒的脂肪酸種類大致相同，但其中12 種脂肪酸含量有不同程度的顯著性差異。

植物源性食品中脂肪酸組成和含量與其生長(zhǎng)地域密切相關(guān)，但各項(xiàng)脂肪酸指標(biāo)易受氣候、土壤等因素的影響，盡管產(chǎn)地不同，但緯度、氣候等因素相近可能造成脂肪酸指標(biāo)的相似性?；诓煌》莼ń分舅岱N類和含量進(jìn)行比較和分析，層級(jí)聚類分析表明陜西和山東省、四川和甘肅省的部分花椒樣品在脂肪酸種類和含量方面具有相似性；進(jìn)一步建立熱圖并進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明陜西、山東、四川和甘肅4 個(gè)省份的花椒樣品中共有5 種脂肪酸的含量相關(guān)性程度較高，而變化趨勢(shì)相近的脂肪酸成分有所差異。