曾穎，曾淑欣，何玉書，林韞琦

（廈門醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361021）

雙水相萃取技術(shù)（aqueous two-phase extraction，ATPS）作為一種新型分離技術(shù)，因其操作條件溫和、連續(xù)性、易放大等優(yōu)勢，越來越受研究者的關(guān)注，并且已被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化工和食品化工等領(lǐng)域[1-3]。雙水相系統(tǒng)是當(dāng)兩種結(jié)構(gòu)不同的聚合物或兩種鹽，或一種聚合物與一種親液鹽在適當(dāng)?shù)臐舛然蛟谝粋€特定的溫度下相混合在一起時形成的互不相溶的兩相系統(tǒng)[4]。

目前，在利用雙水相技術(shù)或優(yōu)化雙水相體系的研究中，通常采用單因素控制變量法、正交設(shè)計[5]、響應(yīng)面法[6]、關(guān)聯(lián)方程式建模[7]等試驗設(shè)計方法，探究各因素變量，如分子量、質(zhì)量分?jǐn)?shù)、系線長度（tie line length，TLL）、溫度、pH 值等對雙水相萃取效果的影響[8-14]。但由于雙水相萃取技術(shù)的理論和分配機(jī)理相關(guān)研究較少，體系的物理、化學(xué)性質(zhì)尚未完全清晰[15]，因此通過以單因素為基礎(chǔ)的試驗設(shè)計方法探究最優(yōu)萃取條件存在一定的局限性[16]。在優(yōu)化雙水相體系過程中，各變量因素的分子之間容易產(chǎn)生新的相互作用力，特別是加入樣品之后，原始的雙節(jié)線會因為樣品的緩沖液環(huán)境等因素干擾發(fā)生一定程度的偏移，導(dǎo)致成相規(guī)律發(fā)生變化，其成相臨界點(diǎn)難以確定，因而在臨界點(diǎn)附近的體系構(gòu)成和優(yōu)化鮮少被探究，致使優(yōu)化后的體系往往不夠全面，在實(shí)際應(yīng)用方面會受到一定的限制且造成材料資源的浪費(fèi)。本文提出一種針對雙水相成相臨界點(diǎn)萃取條件的試驗設(shè)計方法，簡稱“52×3 雙水相試驗法”，是專門為優(yōu)化雙水相臨界萃取體系條件設(shè)計的試驗方法。該方法可以從橫向與縱向的二維角度同時將含樣品的雙水相體系的3 個影響因素（上相、下相、樣品）在其成相臨界點(diǎn)附近由點(diǎn)及面直接進(jìn)行比較優(yōu)化，并消除兩相及樣品在成相時的相互作用和干擾所產(chǎn)生的體系變量誤差，同時大大降低體系的試劑及原料用量成本，具有快速簡便、經(jīng)濟(jì)適用的特點(diǎn)。

本研究采用該方法設(shè)計優(yōu)化雙水相萃取體系，分別從鮑魚內(nèi)臟、扇貝內(nèi)臟、生蠔內(nèi)臟3 種海洋生物的內(nèi)臟中分離提取目標(biāo)酶β-葡萄糖苷酶，分別探究三者的酶活性和萃取效果，以期為未來分離提取和分析海洋生物內(nèi)臟活性物質(zhì)的研究提供一個新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內(nèi)臟（皺紋盤鮑）、扇貝內(nèi)臟、生蠔內(nèi)臟-80 ℃下冷凍儲藏待用；對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-GC）活性檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；對硝基苯酚、碳酸鈉、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、檸檬酸、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）600、1000、1500、2000、4000：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

均質(zhì)乳化機(jī)（A25S）：上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)（3-18K）：德國sigma 公司；制冰機(jī)（AF100）：意大利斯科茨曼制冰系統(tǒng)有限公司；酶標(biāo)儀（Epoch 2）：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

本研究以鮑魚內(nèi)臟為原料，以酶比活為評價參數(shù)，探究雙水相萃取目標(biāo)酶（β-葡萄糖苷酶）的最優(yōu)雙水相體系條件，以解釋并驗證“52×3 雙水相試驗法”的可行性、簡便性與實(shí)用性。

取一定質(zhì)量的鮑魚內(nèi)臟，以1∶4 的質(zhì)量比加入預(yù)冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L pH4.5）[17]，在冰浴中用組織搗碎機(jī)勻漿后，冰浴浸提1 h 后，用高速冷凍離心機(jī)離心（10 000 r/min，4 ℃，15 min），取上清液（粗酶液）待用。

1.3.2 基礎(chǔ)相圖的制作

確定成相的兩物質(zhì)[5]為PEG600（PEG1000、PEG 1500、PEG2000、PEG4000）和NaH2PO4，分別配制成40%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的濃溶液，備用。采用濁點(diǎn)法，在4 ℃環(huán)境下制作兩物質(zhì)的相圖，繪制雙節(jié)線。

1.3.3 最優(yōu)雙水相臨界體系的測定

以PEG600（PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG4000）/NaH2PO4體系與鮑魚內(nèi)臟粗酶液為原料，利用“52×3雙水相試驗法”進(jìn)行優(yōu)化試驗，分別制作“52”表和“3”點(diǎn)圖，以下相酶比活為指標(biāo)，探索從鮑魚內(nèi)臟、扇貝內(nèi)臟、生蠔內(nèi)臟中萃取β-葡萄糖苷酶的最優(yōu)雙水相體系及其對應(yīng)的酶活力與萃取效果。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶相關(guān)參數(shù)計算

β-葡萄糖苷酶（β-GC）活性檢測試劑盒：采用p-NPG 比色法，在400 nm 處的吸光值來測定β-葡萄糖苷酶的酶活，酶活定義：每mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生1 nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位（U），標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=0.002 9x+0.001 9，R2=0.999 1；采用Bradford 法，在595 nm 處的吸光值來測定蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=0.035 2x+0.559 5，R2=0.991 3；萃取目標(biāo)酶以下（鹽）相為主，計算公式如下。

式中：A 為酶比活，U/mg；U 為酶活，U/mL；P 為蛋白濃度，mg/mL；n 為純化倍數(shù)；A下為下相酶比活，U/mg；A樣為樣品酶比活，U/mg；η 為萃取率，%；U下為下相總酶活，U/mL；V下為下相總體積，mL；U樣為樣品總酶活，U/mL；V樣為樣品總體積，mL。

1.5 52×3 雙水相試驗法說明

1.5.1 “52”成相臨界點(diǎn)的測定

“52×3 雙水相試驗法”中的“52”點(diǎn)，即以相圖的雙節(jié)線為基礎(chǔ)，選取中心位置的PEG（縱軸）5 個相鄰的臨界成相點(diǎn)為起點(diǎn)，分別固定每個點(diǎn)的PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按固定比例增加鹽（橫軸）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，選取5 個點(diǎn)分別進(jìn)行試驗。

根據(jù)上述雙水相相圖為參考，稱取一定質(zhì)量的40% PEG600（1000、1500、2000、4000）原液和NaH2PO4加入15 mL 的刻度離心管中，加入一定質(zhì)量的粗酶液后，加水補(bǔ)至體系總質(zhì)量為10 g，充分搖勻至無固體沉淀后靜置10 min，4 ℃下3 000 r/min 離心5 min，若體系分相，則記錄上下相體積；若體系未分相，則NaH2PO4加入量增加2%，重新配制體系；成相后，繼續(xù)分別增加兩相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，各配制5 個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)組成的體系進(jìn)行酶比活測定。

1.5.2 “3”點(diǎn)對比與驗證

從上述“52”成相臨界點(diǎn)試驗中補(bǔ)充選取每個比活最高點(diǎn)（橫軸）的左右兩點(diǎn)，共3 點(diǎn)進(jìn)行驗證性試驗，如三點(diǎn)從左到右，第一點(diǎn)或第二點(diǎn)為最優(yōu)，則可確定該體系中的最優(yōu)點(diǎn)；若第三點(diǎn)最優(yōu)，則需按一定間隔繼續(xù)增加鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，至穩(wěn)定的第一點(diǎn)則為最優(yōu)點(diǎn)。

1.5.3 最優(yōu)雙水相臨界體系對比與驗證

對上述“52×3 雙水相試驗法”選取出的5 個不同PEG 分子量大小的最優(yōu)點(diǎn)同時進(jìn)行試驗比較，即可得成相臨界點(diǎn)最優(yōu)雙水相體系PEG/鹽的種類與質(zhì)量組成。以此方法，通過改變體系的組成條件（不同分子量的PEG、不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)組成的PEG 及鹽、不同的粗酶液加入量），可進(jìn)一步探究不同條件影響下雙水相體系的最優(yōu)構(gòu)成條件及規(guī)律。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 進(jìn)行整理和計算，使用Origin（2021）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG/NaH2PO4 雙水相體系總相圖的繪制

分別繪制PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG4000 在4 ℃環(huán)境下的雙水相相圖，合并后如圖1所示。

圖1 PEG/ NaH2PO4 雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of PEG/ NaH2PO4 aqueous two-phase system

相圖的雙節(jié)線上方是兩相起始分相區(qū)，該區(qū)域作為選取不同PEG 種類及PEG 和NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量的參考基線。

2.2 “52×3”成相臨界最優(yōu)體系

在圖1 中PEG600 雙節(jié)線臨界點(diǎn)附近選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%間隔相鄰的“5”個點(diǎn)，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)間隔2%的NaH2PO4的“5”個點(diǎn)，1 mL 粗酶液，補(bǔ)水至10 g 總體系，進(jìn)行3 次平行試驗，測定成相體系下相酶比活，結(jié)果如表1 所示。

表1 PEG600/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 1 Critical extraction of PEG600/NaH2PO4 aqueous twophase system

由表1 可見，最優(yōu)體系出現(xiàn)在成相臨界點(diǎn)附近，從表中結(jié)果選取最優(yōu)體系點(diǎn)，進(jìn)行“3”點(diǎn)驗證，即PEG600 質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變（PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最小變量取2%為最優(yōu)，再縮小容易不成相或體系不穩(wěn)定），將NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)取值范圍間隔縮小至最優(yōu)點(diǎn)（星號點(diǎn)）的加減“1%”，重復(fù)3 次試驗，若最高點(diǎn)為由左到右的第一點(diǎn)或第二點(diǎn)，證明該點(diǎn)體系為最優(yōu)；若最高點(diǎn)出現(xiàn)在第三點(diǎn)，則需以該點(diǎn)為中心點(diǎn)，再次進(jìn)行左右的“3”點(diǎn)驗證，排除誤差，直至最高點(diǎn)出現(xiàn)在第一點(diǎn)或第二點(diǎn)，最終確定萃取臨界點(diǎn)最優(yōu)雙水相體系，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 PEG600/ NaH2PO4 三點(diǎn)驗證圖Fig.2 PEG600/ NaH2PO4 three-point verification diagram

根據(jù)上述“52×3 雙水相試驗法”測定PEG1000/NaH2PO4雙水相萃取粗酶液的成相臨界最優(yōu)體系，結(jié)果如表2 和圖3 所示。

表2 PEG1000/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 2 Critical extraction of PEG1000/NaH2PO4 aqueous twophase system

圖3 PEG1000/ NaH2PO4 三點(diǎn)驗證圖Fig.3 PEG1000/NaH2PO4 three-point verification diagram

根據(jù)上述“52×3 雙水相試驗法”繼續(xù)測定PEG1500/NaH2PO4雙水相萃取粗酶液的成相臨界最優(yōu)體系，結(jié)果如表3 和圖4 所示。

表3 PEG1500/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 3 Critical extraction of PEG1500/NaH2PO4 aqueous twophase system

圖4 PEG1500/NaH2PO4 三點(diǎn)驗證圖Fig.4 PEG1500/NaH2PO4 three-point verification diagram

根據(jù)上述“52×3 雙水相試驗法”繼續(xù)測定PEG2000/NaH2PO4雙水相萃取粗酶液的成相臨界最優(yōu)體系，結(jié)果如表4 和圖5 所示。

表4 PEG2000/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 4 Critical extraction of PEG2000/NaH2PO4 aqueous twophase system

圖5 PEG2000/NaH2PO4 三點(diǎn)驗證圖Fig.5 PEG2000/NaH2PO4 three-point verification diagram

根據(jù)上述“52×3 雙水相試驗法”繼續(xù)測定PEG4000/NaH2PO4雙水相萃取粗酶液的成相臨界最優(yōu)體系，結(jié)果如表5 和圖6 所示。

表5 PEG4000/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 5 Critical extraction of PEG4000/NaH2PO4 aqueous twophase system

圖6 PEG4000/NaH2PO4 三點(diǎn)驗證圖Fig.6 PEG4000/NaH2PO4 three-point verification diagram

采用“52×3 雙水相試驗法”在不同PEG 分子量的雙水相體系中，可以各做出一個“52”體系表和一個“3”點(diǎn)圖。從以上圖表中可以發(fā)現(xiàn)，每種PEG 分子量體系對目標(biāo)酶萃取效果最優(yōu)的組成比例，均出現(xiàn)在雙水相成相臨界點(diǎn)附近，且由于加入的樣品中含有第3 種成分（乙酸-乙酸鈉），導(dǎo)致雙水相的成相臨界點(diǎn)與原始相圖相比，發(fā)生了一定程度的偏移。從“52”體系表可以看出，隨著鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，體系萃取能力總體上表現(xiàn)為逐漸下降或先增后降的趨勢，且隨著PEG 分子質(zhì)量的增加，最優(yōu)體系會偏離成相臨界點(diǎn)更多，萃取效果更好；從“3”點(diǎn)圖可以看出隨著PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，體系萃取能力總體上表現(xiàn)為逐漸下降的趨勢。

2.3 最優(yōu)雙水相臨界體系的對比與應(yīng)用

分別選取5 個PEG 體系中的最優(yōu)體系（Ⅰ：12% PEG600/21% NaH2PO4；Ⅱ：10% PEG1000/20% NaH2PO4；Ⅲ：12% PEG1500/17% NaH2PO4；Ⅳ：10% PEG2000/18% NaH2PO4；Ⅴ：12% PEG4000/15% NaH2PO4），以鮑魚內(nèi)臟、扇貝內(nèi)臟、生蠔內(nèi)臟為原料，同時進(jìn)行下相萃取物總酶活力的比較驗證，結(jié)果見圖7。

圖7 各分子量PEG 最優(yōu)雙水相臨界體系下相萃取目標(biāo)酶總活力Fig.7 The total activity of PEG with different molecular weight optimal aqueous two-phase critical system on extraction of target enzymes

由圖7 可知，最優(yōu)雙水相臨界體系為Ⅴ：12% PEG4000/15% NaH2PO4，其下相萃取的總酶活、酶比活、純化倍數(shù)、酶活回收率如表6 所示。

表6 最優(yōu)雙水相臨界萃取體系萃取目標(biāo)酶的結(jié)果Table 6 systemThe results of extracting target enzymes by the optimal aqueous two-phase critical extraction system

由表6 可知，對目標(biāo)酶的萃取效果上，生蠔內(nèi)臟＞鮑魚內(nèi)臟＞扇貝內(nèi)臟。5 種PEG 分子量分別形成的最優(yōu)雙水相臨界萃取體系中，PEG4000/NaH2PO4的臨界體系對3 種海洋生物內(nèi)臟中的β-葡萄糖苷酶萃取效果最好。雙水相體系對β-葡萄糖苷酶的萃取效果與PEG 相分子量大小呈正相關(guān)性。當(dāng)PEG 分子量比較小時，體系萃取效果不佳，目標(biāo)酶集中在PEG 相，無法萃入鹽相，因此下相收集效果差；隨著PEG 分子量的增加，進(jìn)入鹽相的目標(biāo)酶逐漸增加，其原因可能是隨著PEG 分子量增加，疏水性增大，成相時所分配到的水減少，目標(biāo)酶隨著水相進(jìn)入鹽相，同時，粗酶液預(yù)處理液乙酸-乙酸鈉緩沖液與鹽相均呈酸性，在雙水相體系中會影響體系的pH 值，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)分子的電離度，成相臨界點(diǎn)偏移，最終會影響被分離物質(zhì)在雙水相體系中分配活動，促使目標(biāo)酶富集于鹽相，大量雜蛋白和細(xì)胞碎片則停留在PEG 相和雙水相分界層。此外，從圖7 中還可以發(fā)現(xiàn)，3 種海洋生物內(nèi)臟中均含有豐富的β-葡萄糖苷酶，其中，生蠔內(nèi)臟下相萃取物中總酶活最高，但考慮到鮑魚內(nèi)臟無法食用，取材豐富且成本極低，以變廢為寶的角度來看更加有研究價值。

3 結(jié)論

雙水相萃取技術(shù)能溫和高效的從樣本中分離提取β-葡萄糖苷酶，且保留酶的較高活性和純化率。本研究采用的“52×3 雙水相試驗法”不再僅以常規(guī)的雙水相相圖為依據(jù)，而是直接在試驗中探究加入樣品后的雙水相成相臨界規(guī)律，同時以雙因素（PEG/鹽）試驗快速確定雙水相體系臨界點(diǎn)最優(yōu)的PEG 種類、PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)及鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有效解決了各因素之間相互作用而產(chǎn)生的變量誤差，快速且準(zhǔn)確的構(gòu)建針對試驗樣品的最優(yōu)雙水相萃取體系。同時，本研究通過對3 種海洋生物內(nèi)臟樣本的雙水相臨界萃取試驗驗證了“52×3 雙水相試驗法”的普遍適用性和應(yīng)用性，為后續(xù)優(yōu)化海洋生物酶的提取純化方法提供新的試驗思路和研究基礎(chǔ)。