伍艷婷,舒文瑩,王艷平,周毅,簡曉順

在全球大多數(shù)國家,惡性腫瘤是導(dǎo)致死亡的主要原因[1],迄今為止,惡性腫瘤還沒有絕對的治愈方法。腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,具有隱匿性,對放化療不敏感。其中腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)是腎細(xì)胞癌最常見的亞型,占70%～75%,易發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。針對多種激酶和雷帕霉素靶點的抑制劑可提高KIRC的總體存活率,但治療反應(yīng)因個體而異,大多數(shù)患者最終會產(chǎn)生耐藥性[3]。因此,探索分析對個體化治療或臨床診斷有意義的生物標(biāo)志物,對KIRC的早期診斷和提高生存率十分重要。

自噬在腫瘤的發(fā)生、耐藥性、微環(huán)境相互作用等多個過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自噬的發(fā)生是一個復(fù)雜的多步驟過程,受一系列自噬相關(guān)基因的嚴(yán)格控制,既可以抑制腫瘤的進(jìn)展亦能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[4],惡性腫瘤可以誘導(dǎo)微環(huán)境的非腫瘤細(xì)胞自噬,從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和進(jìn)展[5]。自噬相關(guān)的化療耐藥性是癌癥治療的一大挑戰(zhàn)。目前,自噬相關(guān)基因在多藥耐藥中的作用越來越受重視,研究發(fā)現(xiàn),自噬基因有望成為癌癥的治療靶點[6-8]。

但由于傳統(tǒng)研究的局限性,大多集中在單基因?qū)δ[瘤影響的研究上,很少使用大規(guī)?；虮磉_(dá)隊列研究自噬與KIRC預(yù)后的關(guān)系。近年來,隨著自噬在腫瘤中的作用不斷被研究,研究人員發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因可以作為預(yù)后生物標(biāo)志物并成為潛在的治療靶點[9]。為了更好地探索自噬相關(guān)基因?qū)εR床預(yù)后的影響,利用大型公共數(shù)據(jù)庫篩選和驗證KIRC自噬相關(guān)預(yù)后標(biāo)志物已成為基礎(chǔ)研究的重要補(bǔ)充和發(fā)展趨勢。

本研究通過構(gòu)建一個新的預(yù)后模型用于預(yù)測KIRC患者的總生存期(OS),并探索了由該模型基因定義的獨特分子特征,包括免疫浸潤和潛在的藥物靶點。這為KIRC預(yù)后、免疫治療和藥物敏感性評價提供了一種新的思路和方法,報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從UCSC xena數(shù)據(jù)庫(https://xenabrowser.net/datapages/)下載24種常見癌種的表達(dá)數(shù)據(jù)log2(FPKM+1)(FPKM:每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments)、表型數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù),通過R軟件4.1.2將其表達(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM(每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts)數(shù)據(jù);從人類自噬數(shù)據(jù)庫(http://autophagy.lu/)中下載222個自噬相關(guān)基因,于GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中做與24種常見癌種的生存分析,最終得到159個與癌癥預(yù)后相關(guān)的自噬相關(guān)基因(ARGs)。

1.2 自噬基因集在癌癥中的表達(dá)情況 使用R包“GSVA”進(jìn)行單樣本基因集富集分析(ssGSEA)得到自噬評分(autophagy score)以量化ARGs在24種癌癥中的表達(dá)水平,Kruskal-Wallis分析各癌癥間的表達(dá)是否存在差異;Mann-WhitneyU檢驗評估23種癌癥的腫瘤樣本與正常樣本間的差異[其中腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)無正常樣本,故未納入后面的分析];以自噬評分的中位數(shù)來定義高評分組與低評分組。

1.3 篩選KIRC差異表達(dá)基因 使用“edgeR”包比較KIRC患者的腫瘤樣本和正常樣本的基因表達(dá)差異(來自UCSC xena數(shù)據(jù)庫的counts數(shù)據(jù)),篩選條件為|logFC|> 1,錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05。

1.4 預(yù)后模型的構(gòu)建 將531例KIRC患者數(shù)據(jù)隨機(jī)分為訓(xùn)練集354個(占總KIRC數(shù)據(jù)的2/3)和測試集177個(占總KIRC數(shù)據(jù)的1/3);將159個ARGs與KIRC的差異表達(dá)基因取交集得到差異表達(dá)自噬相關(guān)基因(DEARGs);對訓(xùn)練集進(jìn)行逐步回歸分析、LASSO回歸分析確定最終模型基因,根據(jù)多因素Cox回歸分析的回歸系數(shù)和基因的表達(dá)量,建立風(fēng)險預(yù)后模型,建立預(yù)后模型公式為:風(fēng)險評分(risk score)=∑(基因表達(dá)量×回歸系數(shù)),測試集用于驗證其預(yù)后能力。

1.5 預(yù)后模型的評估和驗證 根據(jù)預(yù)后模型公式計算風(fēng)險評分,以風(fēng)險評分的中位數(shù)來定義高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。繪制生存曲線和受試者工作特征曲線(ROC),并計算曲線下面積(AUC)以評估模型的特異度和敏感度。根據(jù)風(fēng)險評分值進(jìn)行排序,分布曲線、散點圖和熱圖顯示不同風(fēng)險組的風(fēng)險評分分布,患者生存狀態(tài)及模型基因的表達(dá)情況。將風(fēng)險評分與腫瘤大小(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)、種族(Race)、年齡(Age)、性別(Sex)、臨床分期(Stage)、病理分級(Grade)做單因素和多因素Cox回歸分析,確定預(yù)后的獨立影響因素。列線圖、ROC曲線預(yù)測患者1、3、5年的生存率,并對臨床特征進(jìn)行分層做生存曲線分析,以進(jìn)一步分析風(fēng)險評分的臨床潛力。

1.6 預(yù)后模型基因的表達(dá)驗證 使用HPA數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)驗證模型基因在腫瘤組織和正常組織中的蛋白表達(dá)是否與差異表達(dá)分析的結(jié)果一致。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤分析 使用CIBERSORT計算免疫細(xì)胞在每個KIRC患者中的浸潤情況。每種免疫細(xì)胞類型的總比例等于1。Mann-WhitneyU檢驗比較高低風(fēng)險組患者免疫細(xì)胞的浸潤差異情況。

1.8 藥物敏感性分析 從CellMiner數(shù)據(jù)庫(http://discover.nci.nih.gov/cellminer/)中下載NCI-60 細(xì)胞系的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和藥物分析數(shù)據(jù),選取經(jīng)過臨床試驗和FDA批準(zhǔn)的792個藥物結(jié)果。提取模型基因的表達(dá)數(shù)據(jù),計算藥物敏感性(IC50),并進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,最終得到每個模型基因的表達(dá)與藥物敏感性之間的相關(guān)性。以P<0.01對分析結(jié)果進(jìn)行篩選。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 使用R軟件4.1.2對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和結(jié)果可視化。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ARGs在癌癥中的表達(dá)差異情況 ssGSEA結(jié)果顯示, ARGs在KIRC中表達(dá)最高,腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)中表達(dá)最低(圖1A)。Mann-WhitneyU檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),ARGs在14種癌癥的腫瘤樣本與正常樣本之間表達(dá)存在差異(圖1B),其中ARGs在多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)、KIRC、腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)和甲狀腺癌(THCA)的腫瘤樣本中表達(dá)水平高于正常樣本,在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、結(jié)腸癌(COAD)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、肝細(xì)胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、胃癌(STAD)的腫瘤樣本中表達(dá)水平低于正常樣本(圖1C),而在宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、食管癌(ESCA)、KICH、胰腺癌(PAAD)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)、肉瘤(SARC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、胸腺癌(THYM)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)中表達(dá)無差異性。對有差異表達(dá)的癌種進(jìn)行單因素Cox回歸分析,發(fā)現(xiàn)自噬評分與KIRC、LUSC的OS相關(guān)(圖1D)。

注:A.ARGs在各癌癥中的自噬評分;B.正常樣本與腫瘤樣本之間自噬評分存在差異的癌癥;C.正常樣本與腫瘤樣本自噬評分的中位數(shù);D.單因素Cox回歸分析森林圖。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。BLCA.膀胱尿路上皮癌;BRCA.乳腺浸潤癌;COAD.結(jié)腸癌;KIRP.腎乳頭狀細(xì)胞癌;HNSC.頭頸鱗狀細(xì)胞癌;KIRC.腎透明細(xì)胞癌;LIHC.肝細(xì)胞肝癌;READ.直腸腺癌;LUSC.肺鱗癌;GBM.多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤;STAD.胃癌;THCA.甲狀腺癌;PRAD.前列腺癌;LUAD.肺腺癌。

2.2 自噬評分對KIRC患者預(yù)后的影響 生存曲線分析結(jié)果顯示,KIRC低評分患者的預(yù)后比高評分患者差(P=0.039)(圖2A),LUSC高評分患者的預(yù)后比低評分患者差(P=0.034)(圖2D),這與已有文獻(xiàn)結(jié)果一致[10-11]。單因素、多因素Cox回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),自噬評分可以作為KIRC患者預(yù)后的獨立影響因素(圖2B、2C),但不能作為LUSC患者的獨立預(yù)后因素(圖2E、2F)。

注:A.KIRC高低自噬評分組的生存曲線;B、C.影響KIRC預(yù)后的單、多因素Cox回歸分析森林圖;D.LUSC高低自噬評分組的生存曲線;E、F.影響LUSC預(yù)后的單、多因素Cox回歸分析森林圖。

2.3 確定KIRC差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因并構(gòu)建預(yù)后模型 KIRC的正常樣本與腫瘤樣本差異表達(dá)分析結(jié)果得到9 632個差異表達(dá)基因,將其與上述ARGs取交集,得到35個DEARGs(圖3A)。其中有6個基因在腫瘤組織中下調(diào),29個基因在腫瘤組織中上調(diào)(圖3B)。對DEARGs進(jìn)行逐步回歸分析、LASSO回歸分析,最終確定4個模型基因:BAG1、BIRC5、BNIP3、EIF4EBP1?；诙嘁蛩谻ox回歸分析結(jié)果(表1)構(gòu)建預(yù)后模型,發(fā)現(xiàn)BIRC5和EIF4EBP1是高風(fēng)險基因(HR>1),而BAG1和BNIP3是低風(fēng)險基因(HR<1)。風(fēng)險評分=(-0.037)×BAG1表達(dá)量+0.021×BIRC5表達(dá)量+(-0.003)×BNIP3表達(dá)量+0.003×EIF4EBP1表達(dá)量。免疫組化結(jié)果表明,與正常組織相比,KIRC組織中的BAG1(HPA018121)、BIRC5(HPA002830)、BNIP3(HPA003015)和EIF4EBP1(CAB005032)的蛋白水平上調(diào)(圖3C),除BAG1外,其他3個基因的蛋白表達(dá)與DEARGs的表達(dá)結(jié)果一致。

注:A.差異表達(dá)基因與自噬相關(guān)基因維恩圖;B.35個差異表達(dá)自噬相關(guān)基因熱圖;C.正常組織和腫瘤組織4個模型基因的蛋白水平比較。

表1 多因素Cox回歸分析預(yù)后模型基因?qū)︻A(yù)后的影響

2.4 模型對KIRC患者的臨床預(yù)后價值 生存曲線結(jié)果顯示,高風(fēng)險組患者的預(yù)后比低風(fēng)險組患者差(訓(xùn)練集P<0.001,AUC=0.755,見圖4A、4B;測試集P<0.001,AUC=0.695,見圖4C、4D)。風(fēng)險因子關(guān)聯(lián)圖結(jié)果顯示,風(fēng)險評分值越高,患者死亡數(shù)越多,訓(xùn)練集(圖4E)與測試集(圖4F)結(jié)果基本一致。其中熱圖顯示,BIRC5和EIF4EBP1在高風(fēng)險組中上調(diào),是危險因素,而BAG1和BNIP3在高風(fēng)險組中下調(diào),是有利因素,與多因素Cox回歸結(jié)果一致。

注:A、B.訓(xùn)練集生存曲線和ROC曲線;C、D.測試集生存曲線和ROC曲線;E、F.訓(xùn)練集和測試集風(fēng)險因子關(guān)聯(lián)圖,分布曲線(上)、散點圖(中)和熱圖(下)。

單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),構(gòu)建的模型風(fēng)險評分、M分期和N分期均可作為KIRC患者預(yù)后的獨立影響因素(P<0.05)(圖5A、5B)。為了更好地預(yù)測KIRC患者1、3、5年的生存率,構(gòu)建了列線圖(圖5C)并繪制ROC曲線,AUC分別為0.743、0.740、0.699(圖5D)。為了進(jìn)一步研究風(fēng)險評分的臨床預(yù)后潛力,基于臨床特征(TNM分期、臨床分期、腫瘤分級)進(jìn)行生存曲線分析,發(fā)現(xiàn)風(fēng)險評分似乎更適合用于預(yù)測臨床分期、腫瘤分級、T期、M0期和N0期的總生存時間,除M1、N1期外,高風(fēng)險評分患者的預(yù)后均比低風(fēng)險評分患者差(P<0.05)(圖5E)。

注:A、B.單因素、多因素Cox回歸分析森林圖;C、D.列線圖和ROC曲線;E.生存曲線。

2.5 高低風(fēng)險組免疫細(xì)胞浸潤情況比較 基于自噬與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性,計算了每個樣本中腫瘤免疫微環(huán)境22種免疫細(xì)胞的浸潤情況(圖6A),評估了不同風(fēng)險組中免疫微環(huán)境的組成。與低風(fēng)險組比較,高風(fēng)險組中CD8+T細(xì)胞、輔助性濾泡T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞等比例顯著升高,而靜息殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞等比例顯著降低(圖6B、C)。

注:A.KIRC患者22種免疫細(xì)胞浸潤比例;B、C.訓(xùn)練集、測試集高低風(fēng)險組免疫細(xì)胞浸潤差異。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

2.6 模型基因的表達(dá)與多種藥物敏感性的關(guān)系 表2顯示每個基因與藥物敏感性(IC50)最相關(guān)的前4個結(jié)果。在60個癌細(xì)胞系中BAG1與白屈菜紅堿、AM-5992、7-羥基星形孢菌素呈正相關(guān),與INK-128(mTOR抑制劑)呈負(fù)相關(guān);BIRC5與SNS-314(極光激酶抑制劑)、5-氟脫氧尿苷10、博來霉素呈正相關(guān),與司美替尼呈反比;BNIP3與P-529(mTOR抑制劑)、特拉替尼、IDH-C227(IDH1R132H抑制劑)呈正相關(guān),與AM-5992呈負(fù)相關(guān);EIF4EBP1與SNS-314、氟尿苷、奎扎替尼、維甲酰酚胺呈正相關(guān)。

表2 基因表達(dá)與藥物敏感性的相關(guān)性

在8個腎癌細(xì)胞系中BAG1與丁硫氨酸—亞砜亞胺、PF-2771(CENP-E抑制劑)、三氧化二砷呈負(fù)相關(guān),與帕博西尼呈正相關(guān);BIRC5與恩曲替尼、Gandotinib(JAK2抑制劑)、AMD-070(CXCR4選擇性抑制劑)、替沃扎尼呈負(fù)相關(guān);BNIP3與Saridegib(Smo 特異性抑制劑)、阿扎胞苷、卡鉑呈正相關(guān),與CH-5132799(PI3K抑制劑)呈負(fù)相關(guān);EIF4EBP1與AZD-5363、GSK-2141795、Afuresertib、Ipatasertib(AKT抑制劑)呈負(fù)相關(guān),見表2。

3 討 論

目前,盡管有大量研究表明自噬參與了KIRC的惡性進(jìn)展,但以往的研究中僅探索了單個自噬相關(guān)基因與KIRC之間的相關(guān)性[12-16],缺乏對自噬相關(guān)基因在各癌癥中的表達(dá)分析,且與多種癌癥預(yù)后相關(guān)的自噬相關(guān)基因與KIRC患者預(yù)后之間的相關(guān)性尚未明確。雖然目前有文獻(xiàn)報道了自噬相關(guān)基因?qū)IRC患者預(yù)后的影響[17-19],但涉及的基因多,臨床經(jīng)濟(jì)實用性欠缺,且未曾發(fā)現(xiàn)有相關(guān)研究解釋上述所有4個基因在KIRC中的預(yù)后價值。在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因在不同癌癥中的表達(dá)存在差異,其中在KIRC患者中表達(dá)最高。因此構(gòu)建了由BAG1、BIRC5、BNIP3和EIF4EBP1組成的風(fēng)險預(yù)后模型。發(fā)現(xiàn)在KIRC患者中BAG1和BNIP3是低風(fēng)險基因,其表達(dá)越高,患者風(fēng)險值越低;BIRC5和EIF4EBP1屬于高風(fēng)險基因,其表達(dá)越高,患者風(fēng)險值越高。風(fēng)險評分、M分期、N分期可以作為KIRC患者的獨立預(yù)后因素。

腫瘤微環(huán)境中包含各種細(xì)胞,其中浸潤性免疫細(xì)胞占很大比例且特定細(xì)胞對患者的生存有重大影響[20]。例如,腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞可通過多種方式幫助腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移[21-23]。上述免疫浸潤分析結(jié)果表明,與低風(fēng)險組比較,高風(fēng)險組中CD8+T細(xì)胞、輔助性濾泡T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞浸潤比例升高。高風(fēng)險組的評分與患者預(yù)后呈反比,提示這些免疫細(xì)胞浸潤增加可能與KIRC患者的不良預(yù)后有關(guān)。而靜息殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞在高風(fēng)險組中浸潤比例降低,說明這些免疫細(xì)胞的浸潤增加可能與KIRC患者的良好預(yù)后有關(guān)。

近年來,自噬相關(guān)基因在多藥耐藥中的作用受到越來越多的關(guān)注。以往研究報道,在乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌細(xì)胞系中,星形孢菌素可以通過介導(dǎo)自噬蛋白p62的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥性[24],說明可以通過改變自噬水平或抑制自噬相關(guān)基因的表達(dá),在一定程度上提高藥效,從而為臨床用藥提供理論依據(jù)[25]。在本研究中構(gòu)建的4個模型基因分別與多種癌細(xì)胞系的藥物敏感性相關(guān),其中在腎癌細(xì)胞系中,與BAG1表達(dá)呈正相關(guān)的藥物2個,負(fù)相關(guān)的11個;與BIRC5表達(dá)呈正相關(guān)的3個,負(fù)相關(guān)的51個;與BNIP3表達(dá)呈正相關(guān)的3個,負(fù)相關(guān)的1個;與EIF4EBP1表達(dá)呈正相關(guān)的4個,負(fù)相關(guān)的21個。且相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.9以上。這可能為腎癌的預(yù)后提供潛在的藥物治療靶點,但仍需要更多的試驗加以驗證,以評估該模型基因?qū)εR床試驗中新藥的影響,為新藥篩選提供選擇。

綜上所述,在本研究中,筆者從分析預(yù)后自噬相關(guān)基因在泛癌中的表達(dá)差異,聚焦到對KIRC患者的生存預(yù)后分析,確定了一種由4個差異自噬基因(BAG1、BIRC5、BNIP3和EIF4EBP1)組成的新預(yù)后標(biāo)志物模型,同時證明了該模型與KIRC 患者的OS獨立相關(guān),并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤免疫微環(huán)境、藥物敏感性等方面也具有重要意義。但潛在的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的實驗研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

伍艷婷:提出研究方案并設(shè)計課題,實施研究過程,論文撰寫;舒文瑩:確定分析方法,論文修改;王艷平:文獻(xiàn)調(diào)研,資料搜集和數(shù)據(jù)整理;周毅:課題設(shè)計審核;簡曉順:提出研究思路,論文審核