沈倩妮,王蘇,劉恒娟,李亞男,龔平

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)作為目前缺血性腦卒中的主要防治焦點(diǎn),其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣[1]。而伴有糖尿病的患者由于其抗氧化、抗炎能力降低,導(dǎo)致血管脆性增加,更易誘發(fā)腦損傷[2]。因此,積極尋找新的治療方案以減輕糖尿病患者CIRI帶來(lái)的負(fù)擔(dān)具有重要意義。C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白-6(C1q/tumor necrosis factor related protein 6,CTRP6)作為CTRP家族的成員,與多種疾病的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)[3]。研究證實(shí),CTRP6可防止多柔比星引起的心臟損傷并激活蛋白激酶B(PKB/AKT)通路[4]。然而CTRP6是否可以通過(guò)調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/heme oxygenase-1,Nrf2/HO-1)通路進(jìn)而改善糖尿病小鼠CIRI目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討CTRP6調(diào)控的Nrf2/HO-1通路在糖尿病小鼠CIRI中的作用,以期為改善糖尿病患者CIRI的預(yù)后提供新思路,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:清潔級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠18只,9～10周齡,體質(zhì)量(23±2)g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心SPF環(huán)境,給予12 h/12 h光/暗條件(燈亮?xí)r間為07:00),濕度(65±5)%,溫度(25±1)℃,常規(guī)喂養(yǎng)顆粒飼料。隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham)、腦缺血再灌注組(IR)、腦缺血再灌注+CTRP6過(guò)表達(dá)組(IR+CTRP6),各6只。(2)主要試劑:STZ、TTC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)-CTRP6購(gòu)自上海Hanbio公司,Nrf2、HO-1、NQO-1、NF-κB、p-NF-κB、IKK、p-IKK抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,SOD、CAT、MDA試劑盒購(gòu)自南京建成公司,IL-1β、TNF-α、MCP-1試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司,Caspase-3試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision公司,Caspase-9試劑盒購(gòu)自上海生工生物公司,ApopTag Plus凋亡熒光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2021年9月—2022年6月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠糖尿病模型建立:小鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg,連續(xù)5 d,而后檢測(cè)其空腹血糖,空腹血糖大于13.9 mmol/L時(shí)認(rèn)為糖尿病模型制備成功。參照文獻(xiàn)[5-7],IR+CTRP6組小鼠予STZ后3周接受AAV-CTRP6腦室注射,再過(guò)3周后參照文獻(xiàn)[8]建立大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型。麻醉小鼠后于頸部正中切口,分離左頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈,結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈,夾閉頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端,在靠近頸總動(dòng)脈結(jié)扎處插入線(xiàn)栓至稍感阻力后停止,固定線(xiàn)栓并縫合。線(xiàn)栓置入60 min后拔出并恢復(fù)灌注。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 小鼠腦梗死面積檢測(cè):MCAO后24 h處死小鼠,收集大腦組織并沿冠狀位切片(厚度約2 mm)。切片用TTC在37℃水浴箱中孵育30 min,10%福爾馬林固定過(guò)夜。次日掃描并用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3.2 Western-blot檢測(cè)Nrf2、NF-κB通路相關(guān)蛋白:在含有蛋白酶抑制劑顆粒的RIPA裂解緩沖液中加入腦組織,8%～12%的SDS-PAGE電泳凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后室溫下5%脫脂牛奶-PBS阻斷2 h,并加入Nrf2、HO-1、NQO-1、NF-κB、p-NF-κB、p-IKK、IKK抗體(1∶1 000),4℃下孵育過(guò)夜。次日用相應(yīng)的含HRP的二抗和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑再次孵育,Image J對(duì)印跡條帶進(jìn)行量化。

1.3.3 氧化應(yīng)激及炎性因子檢測(cè):取腦組織用預(yù)冷的PBS漂洗去除血液,濾紙吸干稱(chēng)重,按比例配置組織勻漿液,離心后取上清置于冰上待測(cè)。WST-1法檢測(cè)SOD,可見(jiàn)光法檢測(cè)CAT,TBA法檢測(cè)MDA,ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-α、MCP-1水平,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4 Caspase活性及TUNEL染色檢測(cè):使用Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒對(duì)Caspase活性進(jìn)行檢測(cè),操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)說(shuō)明書(shū)采用ApopTag Plus原位凋亡熒光素檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下觀察并通過(guò)Image-Pro Plus軟件分析TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠CIRI后腦梗死面積及相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)比較 與Sham組比較,IR組Nrf2/HO-1通路及其下游NQO-1蛋白表達(dá)降低,p-NF-κB/NF-κB與p-IKK/IKK水平升高(P<0.01);與IR組比較,IR+CTRP6組腦梗死面積減少,Nrf2/HO-1通路及其下游NQO-1蛋白表達(dá)升高,p-NF-κB/NF-κB與p-IKK/IKK降低(P<0.01),見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腦梗死面積與Nrf2、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.2 各組小鼠CIRI后氧化應(yīng)激及炎性因子表達(dá)比較 與Sham組比較,IR組SOD、CAT活性降低,MDA含量、IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)水平升高(P<0.01);與IR組比較,IR+CTRP6組SOD、CAT活性升高,MDA含量、IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)水平降低(P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠氧化應(yīng)激及炎性因子水平比較

2.3 各組小鼠CIRI后凋亡因子及細(xì)胞凋亡表達(dá)比較 與Sham組比較,IR組Caspase-3、Caspase-9活性升高,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多(P<0.01);與IR組比較,IR+CTRP6組Caspase-3、Caspase-9活性降低,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠凋亡因子及細(xì)胞凋亡比較

3 討 論

大量證據(jù)表明,氧化應(yīng)激是誘發(fā)缺血性腦卒中的重要機(jī)制之一,再灌注后氧自由基增多會(huì)對(duì)細(xì)胞造成直接損害,而機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡又可導(dǎo)致多種信號(hào)通路的激活[9]。糖尿病患者中過(guò)多的活性氧(ROS)可進(jìn)一步誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷等,同時(shí)ROS還可引發(fā)后續(xù)的瀑布樣炎性反應(yīng)[10]。以上研究表明ROS的產(chǎn)生和炎性介質(zhì)的累積可觸發(fā)神經(jīng)損傷。

研究證實(shí),CTRP6參與了心腦血管代謝疾病的發(fā)生進(jìn)展,亦與胰島素抵抗和糖尿病密切關(guān)聯(lián)[11]。另有研究認(rèn)為,CTRP6能對(duì)急性刺激做出反應(yīng)并在營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩的情況下發(fā)揮作用,通過(guò)誘發(fā)“生理性炎性反應(yīng)”以限制脂肪組織擴(kuò)張[12]。本研究發(fā)現(xiàn)再灌注后小鼠腦梗死面積增大,當(dāng)補(bǔ)充CTRP6后小鼠梗死面積降低。因此進(jìn)一步探討CTRP6在CIRI中的具體機(jī)制及其與氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的關(guān)系,對(duì)預(yù)防CIRI有重要價(jià)值。

Nrf2/HO-1通路作為機(jī)體內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制,被認(rèn)為是對(duì)抗氧化應(yīng)激的主要細(xì)胞防御手段[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病CIRI后Nrf2/HO-1通路及其下游的NQO-1表達(dá)下降,而調(diào)控炎性介質(zhì)的NF-κB通路及其下游IKK的磷酸化升高,表明再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致腦組織中氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的升高。新近研究發(fā)現(xiàn),Nrf2和NF-κB之間存在分子串?dāng)_現(xiàn)象,在一定程度上可使細(xì)胞更精細(xì)地調(diào)節(jié)其對(duì)應(yīng)激的反應(yīng),而Nrf2與NF-κB的失衡則會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[14]。當(dāng)過(guò)表達(dá)CTRP6后Nrf2/HO-1通路及其下游分子表達(dá)增加,機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng),NF-κB通路及其下游IKK的磷酸化降低,機(jī)體促炎水平減弱。

在糖尿病狀態(tài)下,炎性因子作為與缺血性腦卒中密切相關(guān)的機(jī)制之一,可激活小膠質(zhì)細(xì)胞并招募白細(xì)胞分泌細(xì)胞因子形成促炎微環(huán)境,進(jìn)一步加劇糖尿病小鼠腦損傷[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),再灌注后小鼠SOD、CAT活性降低,MDA含量升高,而IL-1β、TNF-α、MCP-1的表達(dá)增多。過(guò)表達(dá)CTRP6后氧化應(yīng)激和炎性因子的積累明顯降低,證實(shí)CTRP6通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎性因子的表達(dá)在糖尿病CIRI中發(fā)揮保護(hù)作用。

凋亡作為決定卒中結(jié)局的關(guān)鍵因素,其可在腦缺血發(fā)生數(shù)分鐘后啟動(dòng),并在整個(gè)卒中過(guò)程中持續(xù)存在,抑制神經(jīng)元的凋亡可有效減輕糖尿病小鼠腦缺血再灌注損傷[16]。研究顯示,CTRP6可減輕TNF-α誘導(dǎo)的唾液腺細(xì)胞凋亡以及IR損傷誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡[17-18]。研究發(fā)現(xiàn),CTRP6可通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路保護(hù)心臟免受阿霉素(DOX)誘導(dǎo)的心肌凋亡[4]。與CTRP6在其他細(xì)胞類(lèi)型中的抗凋亡作用相一致,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CIRI后Caspase-3與Caspase-9活性升高,同時(shí)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多,補(bǔ)充CTRP6可降低Caspase的活性,減少凋亡細(xì)胞數(shù)量。

綜上所述,在糖尿病CIRI期間Nrf2/HO-1通路抑制,NF-κB通路激活,進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎性因子、細(xì)胞凋亡增加,而過(guò)表達(dá)CTRP6可顯著減輕腦損傷。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

沈倩妮、王蘇:實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);劉恒娟:資料搜集整理;李亞男:分析數(shù)據(jù);龔平:課題設(shè)計(jì),論文審核