胡海梅 江峰 陳開(kāi)松 李泓利 賈雯

摘 要：冰箱是保存食品的常用設(shè)備，其低溫條件可有效延長(zhǎng)食品的貯藏期，延緩食品的腐敗變質(zhì)，也在很大程度上保留了食品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但在低溫條件下仍有部分嗜冷、耐冷微生物可以存活甚至生長(zhǎng)繁殖，是人們感染食源性疾病的可能來(lái)源。本文以雞胸肉為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)在冰箱中不同溫度條件下的短期貯藏，通過(guò)微生物多樣性檢測(cè)和微生物分離純化測(cè)序，分離鑒定出在低溫下仍可生存的微生物，其中包括可能的致病微生物，以期為肉類(lèi)食品在冰箱貯藏過(guò)程中的食品安全問(wèn)題研究提供參考。

關(guān)鍵詞：冰箱；低溫；雞胸肉；微生物；食源性疾病

Microbial Changes in Chicken Breast Stored in Refrigerator

HU Haimei1， JIANG Feng1， CHEN Kaisong1， LI Hongli2， JIA Wen2

（1.Changhong Meiling Co.， Ltd.， Hefei 230031， China; 2.School of Food Science and Nutrition Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： Refrigerator is a common equipment for preserving food， and its low temperature conditions can effectively extend the storage period of food， delay the deterioration of food， and also retain the nutrients of food to a large extent. However， under low temperature conditions， some cold-loving and cold-tolerant microorganisms can survive and even grow and reproduce， which is a possible source of food-borne diseases. This paper takes chicken breast as the research object. After short-term storage in the refrigerator at different temperatures， microorganisms that can survive at low temperatures， including possible pathogenic microorganisms， are isolated and identified through microbial diversity detection and microbial isolation and purification sequencing， in order to provide references for the study of food safety problems in the storage process of meat in the refrigerator.

Keywords： refrigerator; low temperature; chicken breast; microorganism; foodborne disease

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素之一。但在低溫條件下，部分嗜冷、耐冷微生物仍能存活甚至生長(zhǎng)繁殖，長(zhǎng)時(shí)間貯藏也會(huì)導(dǎo)致食材品質(zhì)劣變，一些致病微生物可能會(huì)引發(fā)食源性疾病[1]。雞肉是最常見(jiàn)的肉類(lèi)之一，是人們膳食結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂的重要來(lái)源[2]。為進(jìn)一步降低食材自身攜帶微生物給消費(fèi)者帶來(lái)的潛在危害，并提高食材的貯藏期限，了解在冰箱不同貯藏環(huán)境中食材攜帶的微生物種類(lèi)尤為重要。因此，本文選用雞胸肉進(jìn)行短期貯藏，通過(guò)微生物多樣性檢測(cè)分析在冰箱不同溫度條件下可存活的微生物種類(lèi)以及優(yōu)勢(shì)菌種，以期為家用冰箱低溫保鮮技術(shù)、低溫殺菌技術(shù)等的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022年6月至2022年8月在北京市海淀區(qū)3個(gè)大型超市（5份/超市）購(gòu)買(mǎi)共15份雞胸肉樣品，在超凈工作臺(tái)中，將每份雞胸肉品分成5份，分別放入5個(gè)無(wú)菌袋中，確保每個(gè)保鮮袋中的樣品質(zhì)量為25 g。將無(wú)菌保鮮袋封好后分別放置于常溫（25 ℃）、4 ℃、?3.5 ℃、?18 ℃和?32 ℃條件下貯藏24 h。

1.2 儀器與試劑

LB固體培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）瓊脂培養(yǎng)基，北京酷來(lái)搏科技有限公司；孟加拉紅（Rose Bengal Chloramphenicol Agar，RBC Agar）培養(yǎng)基，上海申啟生物科技有限公司；Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶，New England Biolabs公司；瓊脂糖，美國(guó)Amresco公司；DC301凝膠回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；T100? PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-7C型電泳儀，北京市六一儀器廠(chǎng)；5424型高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微生物的培養(yǎng)

將雞胸肉樣品在常溫（25 ℃）、4 ℃、?3.5 ℃、?18 ℃和?32 ℃條件下貯藏24 h后取出，在超凈工作臺(tái)中待其解凍后用一次性無(wú)菌棉簽取樣棒蘸取樣品不同部位浸出液，將棉簽取樣棒浸入25 mL無(wú)菌水中，使取下的微生物溶于無(wú)菌水中，重復(fù)20次上述操作制成混合微生物樣品。將上述獲得的25 mL混合樣品加入盛有225 mL無(wú)菌水的錐形瓶中進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)浞只靹?，制?∶10的樣品勻液。再取1 mL的1∶10樣品勻液注入含有9 mL無(wú)菌稀釋液的15 mL滅菌管中，反復(fù)吹吸混勻，制成1∶100的樣品勻液。重復(fù)上述操作程序至制備得到10-7梯度稀釋液。

制備LB固體培養(yǎng)基、麥芽汁固體培養(yǎng)基和孟加拉紅固體培養(yǎng)基，分別用于分離細(xì)菌、酵母菌和霉菌。選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋梯度分別吸取1 mL樣品至上述3種選擇性固體培養(yǎng)基表面，使用經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌的涂布器將樣品均勻涂布至培養(yǎng)基表面，直至培養(yǎng)基表面干燥。同時(shí)分別取無(wú)菌水作為空白對(duì)照。細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)24～48 h，真菌（酵母和霉菌）于28 ℃培養(yǎng)48～72 h，培養(yǎng)過(guò)程中平板倒置。

1.3.2 微生物的分離純化

本研究?jī)H針對(duì)?18 ℃貯藏條件下樣品中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行微生物的分離與純化操作。選擇適宜稀釋梯度的平板（平板上有盡可能多的單菌落，同時(shí)不出現(xiàn)菌苔）進(jìn)行分離操作，對(duì)該平板上每個(gè)單菌落采用平板劃線(xiàn)法進(jìn)行分離，并進(jìn)行編號(hào)。對(duì)第1次分離得到的菌落按照上述操作挑取單菌落進(jìn)行分離，直至完成微生物的純化。將純化后的菌株置于?80 ℃保藏，以備后續(xù)研究使用。

1.3.3 微生物的多樣性檢測(cè)和菌株鑒定

選擇1.3.1中適宜稀釋梯度的平板（菌落多且無(wú)菌苔），采用0.9%生理鹽水（提前滅菌）進(jìn)行平板洗脫，將洗脫的菌液收集于15 mL離心管中。對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，引物為27F和1429R[3]；對(duì)真菌進(jìn)行ITS擴(kuò)增子測(cè)序（ITS-1和ITS-4）[4]。引物序列如表1所示，真菌擴(kuò)增片段為400～700 bp，細(xì)菌擴(kuò)增片段約1 400 bp。PCR程序設(shè)置為預(yù)變性（94 ℃）5 min，變性（94 ℃）0.5 min，退火（58 ℃）0.5 min，延伸（72 ℃）1.6 min，最終延伸（72 ℃）10 min，循環(huán)30次。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增片段，用凝膠回收試劑盒回收和純化目的片段。PCR產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用SnapGene軟件將DNA序列進(jìn)行拼接校對(duì)后，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心進(jìn)行Blast檢索，根據(jù)比對(duì)結(jié)果獲得序列對(duì)應(yīng)的種屬信息。單個(gè)菌株的鑒定方法與此一致。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用DADA2[5]方法生成每個(gè)去重的序列應(yīng)用安全驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)（Amplicon Sequence Variants，ASVs），采用QIIME2的classify-sklearn算法[6-7]對(duì)每個(gè)ASV使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類(lèi)器進(jìn)行物種注釋。根據(jù)ASVs注釋結(jié)果和各樣品特征表，獲得物種豐度表。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰箱不同溫度貯藏環(huán)境中雞胸肉攜帶微生物的多樣性檢測(cè)

雞胸肉中共檢測(cè)到184個(gè)細(xì)菌菌屬。其中，在常溫（25 ℃）條件下共檢測(cè)到109個(gè)菌屬，4 ℃條件下共檢測(cè)到73個(gè)菌屬，-3.5 ℃條件下共檢測(cè)到94個(gè)菌屬，-18 ℃條件下共檢測(cè)到128個(gè)菌屬，-32 ℃條件下共檢測(cè)到82個(gè)菌屬。在各溫度條件下，巨球菌屬（Macrococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為主要的優(yōu)勢(shì)菌。在檢測(cè)到的細(xì)菌Top30中，可能的致病菌屬為8個(gè)。其中，共有常見(jiàn)致病菌屬4種，條件致病菌屬4種。假單胞菌屬（Pseudomonas）在-18 ℃條件下豐度較高，葡萄球菌屬（Staphylococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）在-32 ℃條件下豐度較高。

雞胸肉中共檢測(cè)到104個(gè)真菌菌屬。其中，在常溫（25 ℃）條件下共檢測(cè)到70個(gè)菌屬，4 ℃條件下共檢測(cè)到64個(gè)菌屬，-3.5 ℃條件下共檢測(cè)到50個(gè)菌屬，-18 ℃條件下共檢測(cè)到77個(gè)菌屬，-32 ℃條件下共檢測(cè)到62個(gè)菌屬。在各溫度條件下，皮膚皮狀新絲孢酵母屬（Cutaneotrichosporon）為主要的優(yōu)勢(shì)菌。在檢測(cè)到的所有真菌中，可能的致病菌數(shù)為2個(gè)，且均為常見(jiàn)致病菌。鐮刀菌屬（Fusarium）在-18 ℃條件下豐度較高。

2.2 雞胸肉中分離純化的微生物單個(gè)菌株的鑒定

將-18 ℃條件下短期貯藏雞胸肉中的微生物通過(guò)選擇性培養(yǎng)基分離、劃線(xiàn)純化等操作步驟，分離、純化得到細(xì)菌（37個(gè)）和真菌（50個(gè)）。對(duì)細(xì)菌的DNA 16S V4區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，對(duì)真菌的ITS1區(qū)和18S V4區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。細(xì)菌和真菌的多樣性分析結(jié)果均基于屬水平進(jìn)行分析與討論。測(cè)序結(jié)果顯示雞胸肉樣品中共分離出6株細(xì)菌、3株酵母菌和1株霉菌，如表2所示。

3 結(jié)論與討論

本研究以雞胸肉為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)在冰箱中不同溫度環(huán)境下的短期貯藏，通過(guò)微生物多樣性檢測(cè)和微生物分離純化測(cè)序，分離鑒定出大量在低溫條件下仍可生存的微生物，其中包括可能的致病微生物。目前的家用冰箱設(shè)備均以低溫手段抑制微生物的生長(zhǎng)或?qū)δ承┎荒屠涞奈⑸锲鸬綒⒕饔肹8]，但研究表明簡(jiǎn)單的低溫貯藏仍會(huì)使人們具有一定的感染微生物的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需對(duì)冰箱合理分區(qū)、定期清潔冰箱、及時(shí)關(guān)注食材保存狀態(tài)，從而預(yù)防食品受到微生物污染，保障人們的飲食安全。冰箱冷凍室貯藏的肉類(lèi)食品含有各種耐冷微生物，可能導(dǎo)致冰箱冷凍室的污染，存在安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究在-18 ℃條件下純化的細(xì)菌和真菌可以作為開(kāi)發(fā)冰箱冷凍殺菌方法的目標(biāo)菌，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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