陳婉婷,鄭仁林

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621100)

腫瘤靶向治療正在成為抗擊癌癥的一顆新星,靶向肽是一類靶向腫瘤細(xì)胞和組織的多肽,毒副作用小,可與抗癌藥物偶聯(lián)用于早期腫瘤病變部位的診斷和特異性給藥,在治療癌癥方面有著良好前景。PDC將細(xì)胞靶向多肽與藥物分子偶聯(lián)起來(lái),以增加藥物分子的靶向性,將藥物分子集中在目標(biāo)組織,并降低在其他組織的相對(duì)濃度,進(jìn)而提高藥物的療效并減少副作用[1]。作為腫瘤靶向載體,腫瘤靶向肽的優(yōu)點(diǎn)很多,比如它易于合成,可以輕松引入結(jié)構(gòu)修飾,支持合理的藥物設(shè)計(jì),提高穩(wěn)定性、親和力和生物利用率。此外,腫瘤靶向肽還具有低免疫原性。腫瘤靶向肽不僅可以與抗腫瘤藥物偶聯(lián)而起到靶向治療腫瘤的作用,也可以與成像試劑和腫瘤診斷試劑偶聯(lián),以實(shí)現(xiàn)腫瘤顯影和標(biāo)記的目的。迄今,人們已經(jīng)對(duì)多肽偶聯(lián)藥物有相當(dāng)多的報(bào)道,然而,腫瘤靶向肽在多肽偶聯(lián)藥物中的使用相關(guān)的詳細(xì)報(bào)道尚很少見。本文綜述了腫瘤靶向肽在多肽偶聯(lián)藥物中的研究進(jìn)展,詳細(xì)介紹了腫瘤靶向肽的篩選方法、分類以及已上市多肽偶聯(lián)藥物使用的靶向肽。

1 腫瘤靶向肽的篩選方法

腫瘤靶向肽可以對(duì)腫瘤的血管和腫瘤的相關(guān)受體進(jìn)行特異性的識(shí)別,然后實(shí)現(xiàn)其靶向性。不斷發(fā)展的抗腫瘤研究技術(shù),讓很多靶向腫瘤的肽被發(fā)掘出來(lái)。目前主要有三種方法對(duì)腫瘤靶向肽進(jìn)行篩選:噬菌體展示技術(shù)、化學(xué)合成肽庫(kù)篩選、計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)腫瘤特異性靶點(diǎn)。

1.1 噬菌體展示技術(shù)篩選

噬菌體展示技術(shù)篩選目標(biāo)多肽的基本原理是將指定多肽一段基因序列插入到噬菌體的基因序列中,讓植入外源基因的噬菌體感染細(xì)菌,多次轉(zhuǎn)染篩選及淘汰、洗脫擴(kuò)增后得到通過(guò)噬菌體表達(dá)的目標(biāo)多肽。

固相與肽庫(kù)的靶蛋白分子經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的孵育后,會(huì)產(chǎn)生未結(jié)合的游離噬菌體被洗去,然后競(jìng)爭(zhēng)受體或酸洗脫與靶分子吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞,經(jīng)過(guò)繁殖擴(kuò)增,再進(jìn)行下一輪的洗脫,一個(gè)“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的過(guò)程就產(chǎn)生了。與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體,經(jīng)過(guò)3～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”,得到高度濃縮。由此產(chǎn)生的噬菌體制劑可用于進(jìn)一步富集具有所需結(jié)合特性的目標(biāo)多肽。這種從組合庫(kù)中高通量篩選特定噬菌體和提取多肽的方法,對(duì)研究多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力很有幫助,應(yīng)用較為廣泛。

1.2 化學(xué)合成肽庫(kù)篩選

化學(xué)合成肽庫(kù)(Synthetic Peptide Library)是以化學(xué)合成法隨機(jī)合成特定長(zhǎng)度的多肽集合。由組成多肽的氨基酸數(shù)量決定庫(kù)容量大小的20種天然氨基酸,可作為合成肽庫(kù)時(shí)的構(gòu)建單元。化學(xué)合成肽庫(kù)與生物合成肽庫(kù)相比,其優(yōu)點(diǎn)在于氨基酸構(gòu)成肽,可以是非天然氨基酸。

各種偶聯(lián)縮合劑和固相多肽合成儀的發(fā)展使研究人員能夠獲得大量不同序列的短肽,這些肽一般由4～12個(gè)非天然或天然構(gòu)型的氨基酸組成。通過(guò)修飾氨基酸、改變氨基酸的序列順序、替換氨基酸等方法,能夠構(gòu)建大量的多肽化合物庫(kù),獲得多肽后再建立適合的親和色譜體系,以測(cè)定優(yōu)先序列和先導(dǎo)序列的表觀解離常數(shù),經(jīng)過(guò)優(yōu)化和篩選,可以得到對(duì)配體具有高親和力的短肽[2]。Teerapat Ananuchatkul等人利用化學(xué)修飾方法設(shè)計(jì)的肽庫(kù)通過(guò)添加人工功能團(tuán)進(jìn)行修飾而得到擴(kuò)展。他們利用噬菌體展示和化學(xué)修飾相結(jié)合的方法,創(chuàng)建了一個(gè)吻合器α-螺旋肽庫(kù),其結(jié)構(gòu)受短鏈連接處的限制,從而推動(dòng)了一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)具有高親和力和特異性的肽配體。不復(fù)雜的多肽固相合成和高純度的產(chǎn)物,可以通過(guò)人工修飾得到多種非天然多肽,這提供了一個(gè)珍貴的多肽化合物庫(kù),以找到適合的腫瘤靶向多肽。

1.3 計(jì)算機(jī)輔助肽設(shè)計(jì)

結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),許多沒(méi)有固定形態(tài)的蛋白質(zhì)通過(guò)含有柔性肽段的肽識(shí)別域(Peptide-recognition Domain)與靶標(biāo)蛋白結(jié)合,介導(dǎo)瞬時(shí)可逆的動(dòng)態(tài)蛋白-蛋白之間的相互作用。蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的迅速發(fā)展積累了大量的序列信息和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),僅靠人工實(shí)驗(yàn)方法加工處理這些信息成本較高、耗時(shí)耗力。計(jì)算機(jī)輔助肽設(shè)計(jì)(Computer Aided Peptide Design)應(yīng)運(yùn)而生,它在充分發(fā)揮計(jì)算機(jī)人工智能、圖形處理和數(shù)據(jù)挖掘等技術(shù)作用的基礎(chǔ)上,結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬、分子對(duì)接和定量構(gòu)效關(guān)系等方法,將合理的藥物設(shè)計(jì)過(guò)程與計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)技術(shù)相結(jié)合,為多肽設(shè)計(jì)提供高效合理的理論指導(dǎo)。在結(jié)合腫瘤靶點(diǎn)時(shí),腫瘤靶點(diǎn)肽和腫瘤靶點(diǎn)有關(guān)鍵的錨定殘基。研究人員開發(fā)了一系列計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算軟件,能夠根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫(kù)(Protindbank,PDB)提供的腫瘤靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)與多肽作用力,并利用模擬計(jì)算獲得配體與受體相互作用力的能量、類型、氨基酸殘基制程之間的距離等信息,通過(guò)分析大量腫瘤靶點(diǎn)與非靶點(diǎn)的數(shù)據(jù),設(shè)計(jì)出一系列靶向多肽,篩選出更優(yōu)秀的多肽。

2 腫瘤靶向肽分類

研究表明,腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的各種受體的表達(dá)狀態(tài)與正常細(xì)胞有所不同[3]。此外,腫瘤微環(huán)境在有氧呼吸、血管生成及代謝狀態(tài)等方面與正常組織有明顯差異。具體表現(xiàn)為酸中毒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)表達(dá)異常、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)表達(dá)異常等[4]。因此,在腫瘤細(xì)胞表面、腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面和腫瘤微環(huán)境中具有高表達(dá)受體的配體多肽對(duì)腫瘤組織具有天然的靶向性。此外,還有許多多肽對(duì)細(xì)胞中的各種亞細(xì)胞器也具有靶向性,如核定位信號(hào)肽[5]和線粒體靶向肽[6]。當(dāng)細(xì)胞毒性藥物與這些靶向肽結(jié)合后,就可以被靶向傳遞到腫瘤組織中,從而提高藥物的療效和生物利用度,有效避免對(duì)正常細(xì)胞的損害,降低藥物的全身系統(tǒng)毒性(Systempoxicalpoxide)。

2.1 腫瘤細(xì)胞靶向肽

靶向腫瘤細(xì)胞多肽的受體往往高度表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面,如促性腺激素釋放激素受體(GNRHR)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-IR)等。通過(guò)靶向腫瘤細(xì)胞表面受體的靶向肽對(duì)載體材料進(jìn)行化學(xué)修飾,通過(guò)包裹藥物制造的PDC,以及患者對(duì)藥物的適應(yīng)性,有效提高細(xì)胞毒性藥物的臨床療效和安全性,從而達(dá)到直接靶向腫瘤細(xì)胞的目的[7]。

Pham等利用轉(zhuǎn)肽酶A和一種蛋白連接酶在人類紅細(xì)胞外囊泡與EGFR靶向肽之間建立共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián),促進(jìn)了體內(nèi)EGFR陽(yáng)性肺癌細(xì)胞對(duì)RBCEVs的特異性攝取[8]。此外,將EGFR靶向肽與包載著紫杉醇(Paclitaxel,PTX)的細(xì)胞外囊泡偶聯(lián),顯著增強(qiáng)了該藥物抑制EGFR陽(yáng)性腫瘤生長(zhǎng)的功效。

2.2 腫瘤血管靶向肽

腫瘤生長(zhǎng)和增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求較高,在結(jié)構(gòu)和功能上與正常血管不同。因此,腫瘤靶向治療的一種有前景的策略是以腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn),向腫瘤組織輸送藥物,避免損傷正常組織。

在血管靶向肽中,研究最多的是能識(shí)別腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的V3和V5整合素的RGD肽和NGR肽,它們與整合素發(fā)生交聯(lián),進(jìn)而將目標(biāo)鎖定在腫瘤血管上。在腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上,整合素分子僅在正常細(xì)胞上有微量的表達(dá)。NGR肽能識(shí)別并與多種腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度表達(dá)、對(duì)腫瘤選擇性較好的氨基肽酶N(又稱CD13)結(jié)合。通過(guò)與藥物偶聯(lián)血管靶向肽,實(shí)現(xiàn)主動(dòng)的藥物靶向。當(dāng)RGD肽(GSSSGRGDSPA)與PEG修飾過(guò)的硬脂酸膠束耦合時(shí),通過(guò)表達(dá)整合素的腫瘤會(huì)增加對(duì)其的攝取量,從而使膠束攜帶的藥物更多地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。也有研究用C(RGDyK),即環(huán)狀RGD肽,將含有疏水性化療藥物的膠束輸送給癌細(xì)胞,使其過(guò)度表達(dá)整合素。也有報(bào)告指出,NGR肽與鉑類抗癌藥的耦合,使腫瘤具有更強(qiáng)的定位和結(jié)合性。在脂質(zhì)上的PEG末端附著NGR和STR-R4肽,促使CD13陽(yáng)性細(xì)胞攝取膠質(zhì)體[9]。

2.3 細(xì)胞器靶向肽

細(xì)胞器的獨(dú)特生理功能對(duì)細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器可作為腫瘤治療的目標(biāo),對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞核(Cellnuclear)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu),是細(xì)胞遺傳與代謝調(diào)節(jié)的核心。將藥物靶向到細(xì)胞核,可以克服耐藥細(xì)胞的外排作用,有效地破壞腫瘤細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和功能,造成生理紊亂和細(xì)胞凋亡。然而,細(xì)胞核外的核膜抑制了細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)運(yùn)輸,而大分子活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核需要核靶向分子。細(xì)胞核靶向肽可以成功地將細(xì)胞毒性藥物運(yùn)送到細(xì)胞核中,被廣泛用于協(xié)助藥物進(jìn)入細(xì)胞核。

線粒體是細(xì)胞代謝和有氧呼吸的主要場(chǎng)所,為細(xì)胞代謝提供能量。傳統(tǒng)線粒體靶向腫瘤治療由于傳統(tǒng)線粒體靶向藥物系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性低、腫瘤細(xì)胞富集少、全身系統(tǒng)毒性較高等缺點(diǎn),削弱了腫瘤治療效果,因此采用親脂陽(yáng)離子(如三苯基)作為線粒體靶向基團(tuán)向線粒體遞送細(xì)胞毒性物質(zhì)。線粒體靶向肽為了克服這些缺點(diǎn),通常包含線粒體穿膜肽、Szeto-Schiller肽、線粒體靶向序列[10]等帶有正電荷和疏水性的氨基酸,并被提出取代線粒體靶向分子的親脂性陽(yáng)離子。受損的線粒體會(huì)產(chǎn)生激活CASPASE家族蛋白以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的信號(hào),例如活性氧和細(xì)胞色素C。所以線粒體是最合適的通過(guò)腫瘤光動(dòng)力治療(Photo Dynamic Therapy,PDT)引發(fā)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞器。Sun等人[11]以RGD肽和KLA肽開發(fā)了一種多階段腫瘤靶向脂質(zhì)體(RGD/KLA-modified liposome,RGD-KLA-Lip)負(fù)載紫杉醇(Paclitaxel,PTX),RGD-KLA-Lip具有對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體的靶向運(yùn)輸作用,促進(jìn)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,有效降低細(xì)胞毒性藥物的全身系統(tǒng)毒性。

2.4 細(xì)胞穿膜肽

細(xì)胞穿透肽(Cell-penetratingpeptide,CPP)通常由30個(gè)以下的氨基酸組成,主要是堿性氨基酸,是一類能穿透腫瘤細(xì)胞的肽類。按有無(wú)靶向性分為兩類:以TAT為代表的非靶向穿透肽和以iIRGD為代表的靶向穿透肽。

2.4.1 非靶向穿透肽

TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是由人類免疫缺陷病毒(Human immun odeficiency virus typel)組成的具有正電的富含堿性氨基酸的多肽,由HIV-1編碼。研究發(fā)現(xiàn),其全長(zhǎng)序列和11個(gè)堿性氨基酸富集區(qū)的核心肽段(YGRKRQRRR),能攜帶這些外源生物大分子穿透活體細(xì)胞的各種生物膜性結(jié)構(gòu)(細(xì)胞膜和血腦屏障等),進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮生理功能,在包括蛋白質(zhì)、多肽和核酸在內(nèi)的多種外源生物大分子跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但跨膜傳遞的機(jī)理尚待明確。

2.4.2 靶向穿透肽

靶向穿透肽的作用是既能針對(duì)目標(biāo),又能穿透膜。在腫瘤血管生成過(guò)程中,具有RGD(Argine-Glycine-Aspartic,精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)序列的肽能有效誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞選擇性地將整合素受體大量表達(dá)出來(lái),使之與αvβ3受體結(jié)合在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上。經(jīng)RGD靶向肽修飾的納米載體已證實(shí)可向腫瘤斑塊血管傳遞藥物、SIRNA、造影劑等[12]。但腫瘤靶向治療的主要障礙是腫瘤血管靶向僅在腫瘤血管內(nèi)和腫瘤血管周圍聚集藥物載體,如何有效地將藥物載體穿透血管壁進(jìn)入腫瘤本質(zhì)。

2.5 腫瘤微環(huán)境敏感肽

腫瘤微環(huán)境由免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外間質(zhì)組成,在有氧呼吸、血管生成和代謝狀態(tài)方面與正常組織有明顯不同。腫瘤微環(huán)境的主要生理特征包括微酸度、細(xì)胞內(nèi)外巰基物質(zhì)的不同濃度、部分酶的過(guò)度表達(dá)和低氧。因此,腫瘤微環(huán)境和正常細(xì)胞之間的主要差異為腫瘤靶向治療提供了更多有效的靶點(diǎn)選擇。在眾多的腫瘤微環(huán)境響應(yīng)肽中,酶敏感、pH敏感[13]和還原敏感的肽已被研究人員廣泛使用。例如,MMP家族參與人體重要的生理和病理過(guò)程,在正常組織中少量存在,但在腫瘤微環(huán)境中可高度表達(dá),對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲有重要作用。

Qiu等[14]利用含有MMP-2敏感多肽GPLGLAG的可活化細(xì)胞穿膜肽(Activatable Cell-penetrating Peptide,ACPP)作為橋梁,在金納米棒(Gold Nanorods,GNRs)表面修飾原啉IX(PPIX),得到GNR-ACPP-PIX納米給藥系統(tǒng)。由于ACPP獨(dú)特的U型結(jié)構(gòu)和GNR強(qiáng)烈的近紅外區(qū)光吸收,PpIX的光活性被抑制。當(dāng)納米系統(tǒng)到達(dá)腫瘤組織時(shí),嵌合肽的GPLGLAG肽序列被MMP-2降解,使PEG外殼脫落,細(xì)胞穿膜肽暴露,PPIX的光活性得以恢復(fù),從而促使光敏劑富集于過(guò)度表達(dá)MMP-2的腫瘤細(xì)胞。

2.6 治療肽

腫瘤抗原通過(guò)人體白細(xì)胞抗原(Human Leukocyfe Antigen,HLA)輸送到免疫系統(tǒng)中,由抗原遞呈細(xì)胞(APC)攝取和處理腫瘤抗原,并將抗原輸送到T淋巴細(xì)胞中的一類免疫細(xì)胞中,使免疫系統(tǒng)區(qū)分出正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。從而造成免疫反應(yīng)。因此,腫瘤抗原多肽尤其是只在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的腫瘤特異性表達(dá)抗原肽均可作為免疫治療肽,在以APC和T淋巴細(xì)胞為靶點(diǎn)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫治療方面有著巨大潛力。

Bo?l等人[15]報(bào)道了一個(gè)編碼腫瘤抗原的新基因BAGE,其編碼的ARAVFLAL肽可被T淋巴細(xì)胞識(shí)別。BAGE 基因在正常組織中沉默,在腫瘤部位特異性表達(dá),編碼的抗原作為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的靶向肽,引發(fā)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答。

3 已上市PDC藥物使用的靶向肽

目前FDA批準(zhǔn)的用于臨床癌癥治療的PDC只有兩種:Melflufen和177Lu-Dotatate。

3.1 Melflufen:靶向氨肽酶的多肽

2021年2月27日,美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了Oncopeptides公司研發(fā)的用于治療復(fù)發(fā)和難治性多發(fā)性骨髓瘤(RRMM)的melflufen(PEPAXTO?)。Melflufen在總體人群中的總響應(yīng)率(Overall Response Rate,ORR)為29%,在三級(jí)難治性MM患者中的ORR為26%。該藥物將烷基化劑與靶向氨基酶的多肽偶聯(lián)起來(lái),是一種親脂性二肽的乙基酯化物,由美法蘭和對(duì)氟-L-苯丙氨酸組成。由于其親脂性,melphalan flufenamide可迅速穿過(guò)細(xì)胞膜,并幾乎立即被細(xì)胞質(zhì)中的氨基肽酶水解,產(chǎn)生更多的親水烷基分子,如melphalan和desethl-melflufen。所有人類細(xì)胞中都存在氨肽酶,并過(guò)度表達(dá)于包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的各種腫瘤中。

3.2 Lutathera:生長(zhǎng)激素抑制素

2018年1月26日,由諾華公司研制出的Lutathera(Lutetium Lu 177 dotatate;Advanced Accelerator Applications)注射液獲得FDA批準(zhǔn)上市,是一種放射性標(biāo)記的體肽類似物,用于治療體肽受體陽(yáng)性的GEP-NETs成人患者,包括前中后腸的NETs。

177Lu-dotatate是根據(jù)第三階段NETTER-1研究的結(jié)果而被批準(zhǔn)的。在這項(xiàng)研究中,轉(zhuǎn)移性中腸神經(jīng)內(nèi)分泌的腫瘤患者每8周接受一次177Lu-dotatate(總劑量為四次)與奧曲肽LAR聯(lián)合使用,與單獨(dú)使用LAR相比,在PFS、ORR和OS( Overall Survival,總生存期)方面均有明顯優(yōu)勢(shì)。177Lu-Dotatate利用生長(zhǎng)激素抑制素作為靶向多肽,結(jié)合放射性元素177Lu,在80%以上的高分化神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中表達(dá)出生長(zhǎng)抑素受體,從而為將生長(zhǎng)抑素類似物作為PDC的歸巢肽提供了理想的靶點(diǎn)。

4 結(jié)論

隨著噬菌體展示技術(shù)、多肽固相合成技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助多肽設(shè)計(jì)等技術(shù)的快速發(fā)展,越來(lái)越多的新型腫瘤靶向多肽偶聯(lián)藥物被開發(fā)出[16]。靶向多肽因其多重優(yōu)勢(shì)而被廣泛用于早期癌癥檢測(cè)、癌癥靶向治療和腫瘤治療劑的合成。然而,特異性強(qiáng)、毒性較小的多肽的高效篩選、靶向多肽藥物的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用,以及尋找更有效的靶點(diǎn),是需要不斷研究的問(wèn)題。