段?；?綜述 楊錫彤，羅雪顏，李思穎，王光明 審校

大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院基因檢測中心，云南 大理 671000

染色體異常是新生兒先天性疾病產(chǎn)生的主要原因，會出現(xiàn)多種畸形、身心發(fā)育障礙等嚴(yán)重的臨床癥狀。新生兒先天生長發(fā)育異常和遺傳性疾病為家庭和社會增加了許多負(fù)擔(dān)，但目前尚無針對此類疾病的特異性治療方法，所以及時的產(chǎn)前診斷和干預(yù)對于減少嚴(yán)重的先天性出生缺陷非常重要。染色體嵌合體(chromosomal mosaicism，CM)是指在同一個體中由于不同時期細(xì)胞分裂發(fā)生錯誤，可能導(dǎo)致機體同時存在兩種或兩種以上的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系來源于單個受精卵[1]。許多研究表明CM 的染色體異質(zhì)性與多種人類疾病有關(guān)，會影響健康和疾病中的基因組/染色體不穩(wěn)定性和細(xì)胞間多樣性[2]。目前，在產(chǎn)前篩查過程中CM的存在會影響孕產(chǎn)婦的妊娠結(jié)局是產(chǎn)前診斷的一大難題，由于CM 標(biāo)本來源困難、檢測技術(shù)局限，檢出嵌合體更是面臨著巨大的挑戰(zhàn)。近年來，隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，CM的檢出率也隨之提高，越來越多的CM 病例被報道。本文就CM 的形成機制、致病性及基因檢測技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的最新研究現(xiàn)狀進行闡述，旨在為臨床妊娠結(jié)局和產(chǎn)前遺傳咨詢提供參考。

1 嵌合體形成的機制

嵌合體形成的機制主要有以下幾種：(1)染色體不分離:有絲分裂期間兩條姐妹染色單體未能分離，兩條染色單體被拉到一個細(xì)胞上，產(chǎn)生一個具有單體細(xì)胞系和另一個具有三體細(xì)胞系的嵌合體。(2)后期滯后:當(dāng)染色單體未能黏附到紡錘體上或染色單體黏附到紡錘體上后未能與細(xì)胞核結(jié)合時，就會發(fā)生后期滯后。會導(dǎo)致該染色體在一個細(xì)胞中為單倍體，在另一個細(xì)胞中為正常的二倍體。(3)內(nèi)復(fù)制：又叫多倍體是指染色體在沒有分裂的情況下進行的復(fù)制。導(dǎo)致一個細(xì)胞中為在三體細(xì)胞系的嵌合，另一個細(xì)胞中為二體細(xì)胞系。染色體不分離、后期滯后和內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致非整倍性，有些有絲分裂事件會導(dǎo)致嵌合體，但仍存在二組細(xì)胞系。代替染色體以增益或損失方式呈現(xiàn)，可能會導(dǎo)致單親二倍體(uniparental disomy，UPD)的產(chǎn)生。UPD是指兩條染色體都來自于父親或者母親，其數(shù)目正常但表型異常的染色體[3]。UPD通過印跡基因或者隱性遺傳病基因致病，UPD最常見的染色體是15號染色體，其中兩個父系拷貝被稱為安格曼綜合征(Angelman)綜合征，兩個母系拷貝被稱為普拉德-威利(Prader-Willi syndrome)綜合征。不同機制來源的嵌合體可導(dǎo)致胎兒臨床表型不同和子代再發(fā)風(fēng)險不同，明確嵌合體形成機制可為產(chǎn)前遺傳咨詢提供理論依據(jù)。

2 染色體嵌合體的致病性

在受精卵發(fā)育成胚胎過程中，CM 可出現(xiàn)在胎盤組織、胎兒組織，或二者同時存在[1]。當(dāng)染色體非整倍體僅出現(xiàn)在胎盤組織，而胎兒染色體為正常二倍體，即為限制性胎盤嵌合(confined placental mosaicism，CPM)時，胎兒容易發(fā)生宮內(nèi)生長受限、早產(chǎn)，甚至胎死宮內(nèi)，而母體可發(fā)生子癇前期等妊娠并發(fā)癥。而嵌合體擴展到胎兒被稱為真正的胎兒嵌合體，比CPM更罕見[4]。CM 為流產(chǎn)、先天性異常、發(fā)育遲緩和癌癥的原因，Conlin 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育異常兒童中22%的兒童存在致病性拷貝數(shù)變異，CM 的比例為3.74%，其他研究結(jié)果也顯示在先天性發(fā)育異常的兒童中CM的比例占0.5%～2.0%[6]。

染色體非整倍體是導(dǎo)致先天性疾病的重要原因，研究表明至少10%的人類妊娠可能受到非整倍體的影響[7]。非整倍體嵌合的形成機制復(fù)雜，在減數(shù)分裂/有絲分裂過程中均可發(fā)生，非整倍體的減數(shù)分裂錯誤是妊娠早期流產(chǎn)的主要原因。減數(shù)分裂或有絲分裂染色體錯誤分離的結(jié)果是UPD，影響UPD表型的方法主要為干擾印記染色體區(qū)域和將隱性等位基因減少為純合子。UPD最突出的臨床結(jié)局是印記障礙，印記障礙是由印記基因的平衡等位基因和父母起源特異性表達的改變引起的。盡管超過100 個人類基因受基因組印記調(diào)控，但它們傾向于聚集，因此只有一些染色體和染色體區(qū)域的UPD 與印記障礙表型有關(guān)。臨床上，印記障礙是異質(zhì)性的，它們影響生長、代謝和神經(jīng)運動的發(fā)育。在產(chǎn)前，生長障礙、腹壁缺損和羊水過多可能提示印記紊亂，目前已報道過與UPD相關(guān)的基因組印記障礙疾病包括Silver-Russell 綜合征、Temple 綜合征、Kagami-Ogata 綜合征、MulchandaniBhoj-Conlin綜合征、Beckwith-Wiedemann綜合征、Kagami綜合征、Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、假性低甲狀旁腺素血癥、新生兒短暫性糖尿病等[8]。其次，部分有絲分裂不分離引起的嵌合體，早期胚胎發(fā)育正常到發(fā)育后期形成的三體嵌合可能影響到一部分組織器官其危害較小[9]。非整倍體染色體嵌合的程度與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，較低水平的嵌合導(dǎo)致較溫和的表型，高水平的嵌合會產(chǎn)生嚴(yán)重的表型并且嵌合體患者各組織器官的嵌合比例有可能不同，并隨著年齡增長發(fā)生改變[10]。

性染色體嵌合體中異常核型患兒的臨床癥狀千差萬別，可能會造成胎兒性器官發(fā)育不全，或造成其他臟器結(jié)構(gòu)和功能異常，有時會導(dǎo)致智力低下、精神障礙等臨床表現(xiàn)[11-12]。其中特納綜合征可能是由隱匿性或組織特異性嵌合單體引起的與多種X 染色體失衡相關(guān)，最終導(dǎo)致關(guān)鍵X染色體區(qū)域丟失。由于個體染色體之間的差異，嵌合體的臨床后果難以精確定位和解釋。所以，當(dāng)檢測發(fā)現(xiàn)嵌合體現(xiàn)象時需結(jié)合各種產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)對嵌合體進行綜合分析，并對胎兒形態(tài)進行細(xì)致的超聲評估后才能做出下一步診斷。

3 染色體嵌合體常用的檢測技術(shù)

目前臨床上常用的檢測技術(shù)有染色體核型分析、無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(noninvasive prenatal testing，NIPT)、熒光原位雜交(fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH)、染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)和二代測序技術(shù)(Next Generation Sequencing，NGS)等。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷取材方式有絨毛膜取樣和羊膜腔穿刺術(shù)，在妊娠早期通常采集孕婦的絨毛組織，進行染色體核型分析。羊水染色體核型分析作為傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”能夠直觀地在顯微鏡下識別染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常，并且是檢測染色體非整倍體最直觀最有效的手段[13]。臍血染色體核型分析可對絨毛及羊水培養(yǎng)中出現(xiàn)的假性嵌合體進行驗證，也能在絨毛及羊水培養(yǎng)失敗時進行補救診斷。染色體核型分析對染色體分辨率低，僅能檢出5～10 Mb以上的基因片段缺失或重復(fù)，小于5 Mb的微缺失/微重復(fù)不易檢出，對于低比例嵌合的染色體無法檢出[14]。染色體核型分析標(biāo)本易污染、操作繁瑣、對實驗人員的技術(shù)和實驗條件要求較高，臨床上難以大批量檢測，最終限制了該技術(shù)的發(fā)展。

NIPT 利用大規(guī)模平行測序技術(shù)(MPS)對母體外周血中的胎兒游離DNA(cffDNA)進行深度測序來獲取胎兒的染色體信息，主要用于篩查胎兒染色體非整倍體。NIPT 具有無創(chuàng)性、高敏感性、高特異性和高通量等特點，在產(chǎn)前檢測領(lǐng)域具有一定優(yōu)勢。Robins[15]報道NIPT 不僅可以篩查性染色體的數(shù)目異常，還可以篩查性染色體的嵌合體和CNV(基因拷貝數(shù)變異)，并在提示染色體結(jié)構(gòu)異常中發(fā)揮重要作用。事實上，CMP、母體拷貝數(shù)變異、雙胞胎消失、母體癌癥和真正的胎兒嵌合體等因素會影響NIPT的結(jié)果。鑒于NIPT的篩查性質(zhì)，所有陽性NIPT 結(jié)果都應(yīng)進行侵入性檢查以明確診斷。

FISH是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進化研究等許多領(lǐng)域。其基本原理是用熒光標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢染色體、細(xì)胞或組織中的核酸進行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。通過熒光系統(tǒng)檢測，對待測DNA進行定性或相對定位分析[16]。FISH 相對于傳統(tǒng)的染色體核型分析而言無需進行細(xì)胞培養(yǎng)，具有檢測快速、檢測信號強、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點，能更直觀地顯示染色體的結(jié)構(gòu)改變并能對一些染色體核型分析無法確定的嵌合類型做出輔助診斷，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。FISH 分析的細(xì)胞數(shù)目比染色體核型分析多10 倍，更易檢出低比例嵌合的染色體，是一種前景很好的快速產(chǎn)前診斷技術(shù)。

染色體微陣列分析(CMA)通過陣列比較基因組雜交(a-CGH)或使用單核苷酸多態(tài)性(SNP)陣列進行分析。在產(chǎn)前診斷中，CMA 主要用于檢測染色體失衡，可以準(zhǔn)確檢測染色體失衡的數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常，并可檢測到微缺失和微重復(fù)等染色體改變[16]。與傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)和FISH 技術(shù)相比，使用CMA 進行染色體異常產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷的最大優(yōu)勢在于CMA能夠檢測到更小的失衡，能夠精確定義不平衡區(qū)域。這意味著可以準(zhǔn)確地劃定所涉及區(qū)域的邊界(斷點)，并且可以進一步評估該區(qū)域的基因序列，具有分辨率高、檢測周期短、結(jié)果更客觀的優(yōu)點。其中a-CGH 技術(shù)可以分析基因組拷貝數(shù)變異，在檢測嵌合體方面較傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)方法更敏感。而SNP 技術(shù)可以同時分析單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù)變異，除了能夠檢測染色體CNVs外，還能夠檢出大多數(shù)單親二倍體和三倍體，并可檢出一定水平的嵌合體。許多研究表明，CMA可作為胎兒超聲異常病例的主要產(chǎn)前診斷測試，可將正常核型胎兒的遺傳異常檢出率提高6%～7%[17]。已有研究報道對于產(chǎn)前超聲異常而染色體核型分析正常時，CMA技術(shù)可作為首選檢測方法[18]。

隨著人類基因組圖譜的完成，NGS 技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了DNA 測序。NGS 技術(shù)產(chǎn)生數(shù)百萬或數(shù)十億個短的、高可信度的基因組讀數(shù)，測序讀數(shù)通常為100～150 bp，可以是單讀或雙端測序。NGS 技術(shù)的高通量特性允許對測序片段進行非常高的倍數(shù)覆蓋，并檢測野生型等位基因中低水平的突變變體[19]。NGS技術(shù)具有高通量、高分辨率、檢測費用逐年降低的優(yōu)勢，已經(jīng)被運用到嵌合體檢測方面，和a-CGH 技術(shù)相比NGS 技術(shù)在嵌合體檢測方面更勝一籌[20]。除了NGS 技術(shù)其他方法也用于嵌合體鑒定，包括Sanger測序、高分辨率熔解(HRM)分析、等位基因特異性PCR、焦磷酸測序、SNaPshot 和免疫組織化學(xué)等，在NGS 時代這些技術(shù)在初步篩選和結(jié)果驗證方面也發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)語

染色體嵌合體是產(chǎn)前診斷中一個普遍且復(fù)雜的現(xiàn)象，嵌合體的類型及臨床后果受發(fā)育過程中產(chǎn)生嵌合體的地點、時間等多種因素影響。由于個體染色體之間存在差異導(dǎo)致嵌合體的臨床后果很難確定和解釋，使產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢變得更加困難。近年來基因檢測技術(shù)迅猛發(fā)展，為CM 的產(chǎn)前診斷帶來了技術(shù)保證，合理利用各種檢測技術(shù)可以提高產(chǎn)前篩查中CM 的檢出率和準(zhǔn)確率，為臨床治療和產(chǎn)前遺傳咨詢提供更可靠的診療依據(jù)、減少不必要的流產(chǎn)、預(yù)防新生兒出生缺陷。